1、.装订线山 东 农 业 大 学毕 业 论 文题目：苹果轮纹病菌对药剂的敏感性研究及分子鉴定院 部 植物保护学院 专业班级 动植物检疫（植检方向） 届 次 2010 届 学生姓名 范志航 学 号 20062701 指导教师 刘会香 副教授 山东农业大学学士学位论文2.二 O 一 O 年六月五日说 明一、指导教师评语根据学生实习及撰写论文情况进行评定：1、对待实习的态度及实习纪律的遵守情况；2、能否准确熟练地进行观察记载、搜集整理、查阅资料及运用数据的水平；3、能否准确熟练地进行各项操作，并运用所学知识解决实际问题；4、能否很好地完成任务书规定的工作量。二、评阅教师意见参照以下几方面进行评定：1、
2、论文选题的实用性、分析的科学性和体系的完整性；2、获取资料是否丰富，处理资料是否科学、严谨；3、综合运用基础理论和专业知识的深度、归纳、概括及运算的能力；4、文字表达能力，文章的逻辑性。三、论文答辩成绩由答辩小组根据学生语言表达能力及回答问题的准确性进行评定。四、论文答辩成绩和论文综合评定成绩按优秀、良好、中等、及格和不及格五级计分。五、毕业论文的综合评定成绩按照毕业论文评分标准综合评定。六、论文由学生本人按照毕业论文（设计）规范用计算机排版、打印，一律使用统一封面（16K） 。七、学生的论文文本（含任务书、图片等）由学院按学校规定存档。山东农业大学学士学位论文I目 录中文摘要 .1英文摘要
3、.21. 前言 .31.1 研究背景及意义 .31.2 Botrysphaeria 属真菌的研究现状 .32. 材料与方法 .32.1 材料 .52.1.1 供试菌株 .62.1.2 培养基 .62.1.3 通用引物 .62.1.4 主要药品试剂 .62.1.5 主要仪器 .72.2 分离纯化菌株 .72.2.1 培养基的制备 .72.2.2 菌株的分离纯化 .82.3 分子鉴定 .82.3.1 病原真菌染色体 DNA 的提取 .82.3.1.1 菌丝的获得 .92.3.1.2 提取 DNA 的步骤 .10山东农业大学学士学位论文II2.3.1.3 琼脂糖凝胶的制备 .102.3.2 PCR
4、扩增 .102.3.3 rDNA-ITS 回收纯化 .102.3.4 ITS DNA 序列的测定 .112.4 苹果轮纹病对药剂的敏感性研究 .112.4.1 制备加药培养基与对照培养基 .112.4.2 苹果轮纹病对药剂的敏感性测定方法 .113. 结果与分析 .113.1 不同菌株的培养学和形态学研究 .113.1.1 菌落形态特征 .123.1.2 子实体形态学观察 .123.1.3 不同菌株对温度的适应性研究 .123.1.4 不同菌株的致病性分析 .124. 结论与讨论 .134.1 结论 .134.2 讨论 .13参考文献 .20致谢词 .23Content山东农业大学学士学位论文
5、IIIAbstract.1Chinese abstracts .2English abstracts.21 Intruduction .21.1 Research background and Significance.21.2 Research Status.32 Materials and Methods .62.1 Materials .62.1.1 Isolates.62.1.2 Medium.72.1.3 Universal primer.72.1.4 The main medicines reagents .72.2 Separation and purification.82.2
6、.1 Preparation of medium .82.2.2 Separation and purification.82.2.2.1 The formation of fruiting bodies on medium .82.2.2.2 Fruiting body morphology observation .92.3 Molecular identification .92.3.1 DNA extraction .92.3.1.1 The method of acquire the mycelium.92.3.1.2 The steps of DNA extraction.102.
7、3.1.3 Electrophoresis .102.3.2 PCR amplification .112.3.3 Recycling of ITS DNA sequence2.3.4 Determination of ITS DNA sequence .122.4 The sensitivity of apple ring diseases pathogen for fungicides2.4.1 Preparation of medium2.4.2 The sensitivity of apple ring diseases pathogen for fungicides3 Results
8、 and Analysis.123.1 The cultivation of different strains and morphological study .123.1.1 Colony morphology.123.1.2 Morphological observation of fruiting bodies.193.1.3 Colonies under the conditions of different temperature growth.233.1.4 The pathogenic analysis in different strains .253.2 ITS ampli
9、fication of DNA.314 Conclusion and discussion .324.1 Conclusion.334.2 Discussion.33References .34Acknowledgements .23山东农业大学学士学位论文IV山东农业大学学士学位论文1苹果轮纹病对药剂的敏感性研究及分子鉴定作者：范志航 指导教师：刘会香 副教授（植保学院，山东农业大学，山东 ，泰安 271018）摘要：苹果轮纹病是危害苹果的重要病害之一，近年发生日益严重，其病原菌Botryosphaeria 属真菌是一种危害广泛的树木病原真菌。本论文以山东省 15 个不同地（市）的苹果轮纹病
10、的病原菌 37 个菌株为研究对象，进行分子鉴定，并利用菌丝生长速率法测定了苹果轮纹病菌（Botryosphaeria）对多菌灵、代森锰锌的敏感性。结果表明，苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感程度最高， 关键词：苹果轮纹病菌；毒力；敏感性；多菌灵；代森锰锌；分子The sensitivity of apple ring diseases pathogen for fungicides and molecular appraisalAuthor： Fan Zhi-Hang Supervisor: Liu Hui-Xiang Associate Professor(College of Plant Prot
11、ection , Shandong Agriculture University, Shandong,Taian, 271018 )Abstract：The apple ring disease is one of apple major diseases. In recent years, it is increasingly serious and the pathogenic fungi-Botryosphaeria is a kind of pathogenic fungi against a wide range of trees. This paper taking the pat
12、hogens from 15 different regions and cities in Shandong . For molecular appraisal . And using the determination method of hypha growth rate to assay sensitivity of apple ring diseases pathogen for carbendazim and mancozeb fungicides. It showed 山东农业大学学士学位论文2that the isolates were more sensitive to ca
13、rbendazim than to mancozeb.Keywords：Pathogen of apple ring diseases；virulence；sensitivity；carbendazim；mancozeb ； molecular； 1 前言1.1 研究背景及意义苹果轮纹病是我国乃至世界苹果产区的一种常见性重要病害。枝干轮纹病可以导致树势衰弱，产量剧减或绝产，甚至死树毁园。果实轮纹病可以导致产量下降，品质低劣，甚至霉变溃烂。这两种轮纹病都严重地困扰着苹果生产的持续、快速、健康发展。据苹果轮纹病抗病性鉴定结果表明，在全国各地近 50个栽培品种中，除我国特有的苹果种质资源鸡冠为该病的
14、免疫品种外，其余的所有品种都有程度不同的感病。其中的富士系、红元帅和甜黄魁等近 30 个品种均为易感病品种；国光、红玉和寒富等 7 个品种均为中度感病品种；津轻、宁丰和翠秋等 10 多个品种均为轻度感病品种。苹果果实轮纹病在各地时有发生，一些地方发病达 70%,危害很严重，据中国农科院果树研究所专家预测，每年造成烂果损失达到 30 亿50 亿元人民币。经唐山市农科院植保所研究发现，轮纹病菌在 7 月份侵入果实，在树上生长期间和储藏、运输过程中均会造成“烂果” ，一般烂果率可达到 30%40%左右。并且在发生枝干轮纹病后，病菌大量夺取树体营养，分泌毒素危害树干，并散发大量轮纹病菌，再侵染苹果树，
15、造成树势衰弱、结果期缩短、产量降低、死树等，对果园的生产影响极大。当果实近成熟期，其内部的生理生化发生改变后，潜伏菌丝迅速蔓延扩展，果实才发病。果实采收期为田间发病高峰期，果实贮藏期也是该病的主要发生期。若幼果期适逢降雨频繁，病菌孢子散发多，侵染也多。幼果受侵染不立即发病，病菌侵入后处于潜伏状态。苹果轮纹病主要危害枝干和果实，对叶片危害较少。枝干受害，在皮孔上形成圆形或扁圆形的瘤状物，直径 330 mm，红褐色，坚硬，边缘龟裂与健康组织形成一道环沟。翌年病斑中间生黑色小粒点即分生孢子器。严重时，病组织翘起如马鞍状，许多病斑连在一起，使表皮粗糙。果实受害，在成熟期或贮山东农业大学学士学位论文3藏
16、期，以皮孔为中心，生成水渍状褐色小斑点，很快形成同心轮纹状，并向四周扩大，呈淡褐色或褐色，整个果实软腐。后期在表面形成许多黑色小粒点，即分生孢子器。烂果多汁，有酸臭味。叶片受害，产生近圆形同心轮纹状褐色或不规则褐色病斑，大小 515 mm，渐变为灰白色，并生小黑点，病斑多时，叶片干枯早落。该病的病原菌为真菌，子囊菌亚门核菌纲球壳菌目梨生囊孢壳菌（Physalospora piricola Nose），无性世代为半知菌亚门球壳孢目轮纹大茎点菌（Macrophomakawatsukai Hara）。分生孢子器扁圆形或椭圆型，孔口乳突状，分生孢子纺锤形。病菌以菌丝体、分生孢子器及子囊壳在被害枝干上越
17、冬，是此病下年初次侵染和连续侵染的主要菌源。枝干病组织中的菌丝体可存活 45年，其中前 3 年能形成大量分生孢子。越冬后分生孢子形成的时间因地而异。在江苏徐淮黄河故道地区，58 月均可在田间捕捉到分生孢子，在自然条件下均可侵染果实，侵染期长达 4 个月。病菌侵入途径为果实的皮孔及气孔，当皮孔木栓化后，病菌不能再侵入。空气中分生孢子的密度与降雨量呈正相关 1,2,3。随降雨增多，孢子散发量逐渐增加。据中国农业科学院果树研究所李美娜等 4报道，在辽宁地区，病菌侵染盛期在 6 月下旬8 月中旬，高峰在 7 月上旬8月上旬。分生孢子主要借风雨飞溅传播，其传播距离多为 10 m 左右 1。监测病原菌对药
18、剂的敏感性是合理选用杀菌剂及有效地进行病害防治的基础，因此，我们研究测定苹果产区的苹果轮纹病菌对多菌灵和代森锰锌的敏感性，目的是检测我省苹果产区的轮纹病菌群体对药剂的抗性水平，以期为苹果轮纹病防治的药剂选择与合理使用提供依据，为田间病原菌的抗药风险评估及监测提供信息。1.2 Botryosphaeria 属真菌的研究现状人们对苹果轮纹病已进行了广泛的研究，内容涉及病原菌种类鉴定、生物学性。接种体的产生与传播时期、流行因素及防治技术等方面。Botryosphaeria真菌是寄生性、弱寄生性或腐生性真菌，生态地理适应性极强，寄主范围广泛，无论患病还是健康的阔叶、针叶树种，甚至一些草本植物都有寄生。Botryosphaeria 真菌的有性或是无性孢子可以通过弹射、风媒、雨水喷溅、昆虫
