1、 化学消毒剂作用机理研究进展(1)6600 字摘要: 细胞壁的屏障作用是微生物降低对消毒剂敏感性的普遍机制。消毒剂对细胞膜的作用导致膜的通透性增加, 胞内物质泄漏, 呼吸链被破坏等。一些消毒剂能直接改变、破坏蛋白质和核酸的结构和功能, 但核酸和蛋白质的合成过程可能比结构本身对消毒剂更加敏感。流式细胞仪、单细胞凝胶电泳等新技术的应用将使人们能够更深刻地了解消毒剂的作用机理。关键词: 化学消毒剂, 作用机理, 细胞膜, 蛋白质, 核酸 zuoi 6 的研究显示, 洗必泰作用后链球菌突变体 NC IB11723 的糖酵解速率下降, 但这种下降主要是由于酵解中间产物的泄漏引起的。呼吸被抑制的重要标志是
2、 ATP 合成量的减少。原核生物的呼吸链位于细胞膜上,消毒剂与膜的接触可破坏呼吸链, 导致ATP 合成下降或受阻, 造成细胞死亡。Dinning 等 7 用虫荧光素- 虫荧光素酶生物发光法测定并发现亚抑制浓度的羟基吡啶硫酮就能使胞内 ATP 水平大幅度下降。刘雪林等发现二氧化氯作用 30 s 后大肠杆菌的 ATP 酶活性下降显著。s 8 发现 3 - 氯- 4, 4 - 二甲基- 2 - 噁唑烷酮和 1, 3 - 二氯- 4, 4, 5, 5- 四甲基- 2 - 咪唑烷酮对金黄色葡萄球菌的 K+泄漏和 H+通透性增加作用不大, 但细胞的耗氧量减少, 可见抑制呼吸酶是这两种抑菌剂作用的第一步,
3、并最终会导致微生物失活。目前对呼吸抑制作用的证据主要是氧消耗(或吸收) 的减少或 ATP 合成水平下降等间接指标。但消毒剂具体作用在呼吸链上的哪一个环节或哪一种酶还难以确定, 也许是这些酶难以分离纯化阻碍了这方面的研究。真核生物的呼吸链位于线粒体内膜上,其呼吸链与消毒剂接触的难度比原核生物大, 因此消毒剂对它的能量代谢的作用机制可能更复杂些。 脂肪酸含量变化也被用来分析消毒剂的作用机理。Triclosan 是一种膜作用剂, 但研究显示其对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌及其它细菌的生长抑制作用主要是因为依赖于NADH 的脂酰- ACP 转移还原酶被抑制, 造成脂肪酸合成被停止。刘雪林发现大肠杆菌被二
4、氧化氯杀灭与脂质被氧化有关。另外, 碘类消毒剂、过氧乙酸等也对细胞膜上的脂肪酸发生作用。 论文 用同位素标记法研究消毒剂对蛋白质及核酸合成的影响也是一个重要的研究方法。Viktor 9 用 14 C - Adenine 和 14 C - Leucine 作为合成前体测定了 16 种季铵盐类消毒剂对阴沟肠杆菌( Enterobacter cloacae) 的蛋白质及 DNA 合成的影响, 发现有 15 种消毒剂的 DNA 合成的IC50 小于蛋白质合成的 IC50 , 其中 7 种消毒剂主要作用于 DNA 的合成。似乎阴沟肠杆菌 DNA 合成比蛋白质合成更容易受季铵盐类消毒剂的影响。也有人用同位
5、素掺入法研究了二氧化氯对蛋白质合成的影响。病毒的外壳蛋白( cap sid p rotEin) 一直是研究病毒消杀机理的一个热点。消毒剂与病毒外壳的作用方式与强度因消毒剂和病毒的种类而异。总体而言, 有包膜病毒比裸病毒对消毒剂更敏感。多数化学消毒剂对有包膜病毒几乎都有效, 但季铵盐类、洗必泰、戊二醛对裸病毒的杀灭效果都不甚理想。有研究显示, 病毒基因组不是戊二醛作用的理想位点, 戊二醛主要与病毒外壳上的氨基酸发生交联作用, 特别是与赖氨酸上的 -氨基发生交联。Martine 101 证明了戊二醛对肠病毒的毒力与病毒 VP1 外壳蛋白上的赖氨酸残基的排列顺序有关, 而与其总数目没有明显相关性。3
6、 消毒剂对核酸的作用核酸位于细胞的内部, 真核生物的核酸还有核膜包被, 因此核酸可能是消毒剂最后到达的位点之一。芬顿反应( Fenton reaction) 是一个能产生羟自由基的反应体系( Fe2 + +H2O2 Fe3 + +OH- + OH ) , 常被应用于羟自由基对 DNA 损伤的胞外研究。胞外的 DNA 损伤试验为研究胞内的 DNA 损伤提供了有益的信息 11 。质粒 pSV2neo在芬顿反应处理后, 透射电镜显示其损伤包括形成缺口环状分子、线状分子、单链噜噗( loop) 结构和质粒聚合物等 12 。戊二醛似乎对枯草芽孢杆菌芽孢的 DNA 没有损伤作用。陈春田发现二氧化氯可导致大
7、肠杆菌 DNA 漏出, 但漏出率与杀灭率不成比例。 含氯消毒剂对细菌 DNA 毒性包括形成含氯的核苷酸碱基衍生物, 216mg/L 的次氯酸作用 5min 能彻底抑制大肠杆菌的生长, 对 DNA合成的抑制率为 96% , 而对蛋白质合成的抑制率仅为 10%50% , 因此推断 DNA 合成是对该消毒剂的更为敏感的环节。含氯消毒剂具有杀病毒活性, Olivieri 发现氯( chlorine) 对 f2 噬菌体裸露 RNA 及完整衣壳内的 RNA 有同等的损伤效果 , 但其外壳蛋白仍然能够进入宿主; Taylor 和 Butler 发现 1 型脊髓灰质炎病毒( Poliovirus type 1
8、) 的 RNA 在病毒外壳形态发生明显改变之前即被降解成 RNA 片段; 但 Floyed 和 OpBrien 证实脊髓灰质炎病毒的衣壳也能被严重损坏。此种矛盾结果尚需进一步研究澄清。基因组核酸不是戊二醛作用的理想靶点。对噬菌体 F116 的研究发现, 经戊二醛预处理后的噬菌体颗粒仍有感染铜绿假单胞菌的能力。在病毒 SV40 中, 只有戊二醛、甲醛等能引发蛋白质- DNA 交联的醛类, 才能抑制 DNA 的合成。辛忠涛等 13 研究氯及二氧化氯对甲肝病毒(HAV) 的灭活作用表明, 病毒在抗原被破坏前已失活, 推测可能是核酸遭到了损伤。李君文等 14 用 RT2PCR 步移法及 EL ISA
9、法证实了前者的推测 : 在氯或二氧化氯的作用下, HAV 病毒的感染性丧失与 5端非编码区约600bp 的 RNA 片段被破坏有关。 4 展望由于消毒剂公认的多靶点作用性, 也由于微生物是一个构成复杂的庞大群体, 其细胞组成千差万别, 个体极其微小, 要确切了解消毒剂对它们的作用机理, 其难度不小。只有联合运用生物、化学及物理的方法才能获得比较满意的结果。比如, 消毒剂对核酸的作用总体来说研究得还不够深入。特别是在细菌和真菌的研究方面, 很多研究者还仅仅停留在通过消杀液 OD260 的变化来推测核酸是否受损。实际上即使核酸受损也不一定释放到胞外; 也未见有从 OD260 增高的消杀液中提取到核
10、酸的报道。更深入、细致的研究必须不断地采用新的设备、方法和技术。近二十年来细胞学研究方面的一些新技术, 如流式细胞仪( Floetry) , 单细胞凝胶电泳( Single-cell gel electro-phoresis) 等, 使得人们可以在单细胞水平上探测细胞的死活、膜受损、核酸含量变化以及 DNA的断裂、损伤等, 弥补了以往群体水平研究的不足 15, 16 。已有人尝试将这些技术用于抗菌肽作用机理的研究, 相信在化学消毒机理方面亦可借鉴。 目前的消毒机理主要是以病毒和细菌为材料, 关于真核微生物的研究则鲜有报道。但真核微生物是重要的病原菌之一, 鉴于其细胞结构不同于病毒和细菌, 对其进行专门的消毒机理研究具有理论和实践意义。总之, 人们应从微生物的细胞膜、细胞壁、细胞器、蛋白质、核酸以及细胞的物质能量代谢等方面进行多层面的研究, 力争阐明特定消毒剂在某种(类) 微生物上的首要靶点, 对于可以致 DNA 损伤的消毒剂, 则应阐明这种损伤在致死中的作用。另外, 弄清消毒剂在低浓度和高浓度下作用机理的异同也很重要。
