1、题 目： 花生中植物螯合肽 PC 的研究 学 院： 专 业： 姓 名： 指导教师： 完成日期： 摘要重金属是我们熟知的环境污染物之一，近些年， 工矿业的发展，农药、 化肥的使用，使得重金属对水体，土壤的污染愈来愈严重，而在植物的器官中累积的重金属，最终经过食物链迫害人类。利用植物减轻重金属污染是国内外研究开发的热点。研究发现镉被人体吸收后，在体内变成镉硫蛋白，镉硫蛋白具有选择性，可累积于肾、肝中。其中，进入体内的 1/3 的镉可被肾脏吸收，肾脏是镉中毒的靶器官。其它脏器例如胰、脾、甲状腺和毛发等也会累积一定量。镉在体内可与含氨基、羟基、硫基的蛋白质分子结合，抑制许多酶系统，从而使肝、肾器官中酶
2、系统的正常功能受阻。由于镉会损伤肾小管，病人会出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿的症状。更严重的会使使骨骼的代谢受阻，造成骨质疏松、萎缩等一系列症状，镉的危害已经受到人们极大地关注。本研究以花生形成的植物螯合肽含量为指标，探索了不同浓度的镉诱导花生产生植物螯合肽含量的影响。以在不同重金属铬的环境下生长的花生为原料，利用高效液相色谱-质谱联用仪来测定花生中植物螯合肽的含量。本实验利用 C 反相柱，用乙腈和 1.5%的三氟乙酸检测了花生中在不同浓度镉诱导下形成的植物螯合肽含量。在以上的实验条件下，检出限为 0.25mg/L；线性范围分布在 0.60-0.25mg/L( R2=0.9988)之间，回收率在
3、80% 以上，灵敏度相对较高。选用该方式对花生中的螯合肽做定量分析，证明了花生中有植物螯合肽。结果表明，重金属镉污染的花生中都检出不同浓度的植物螯合肽。本实验的目的在于为重金属镉污染的减弱做一份贡献。关键字：镉污染；花生；植物螯合肽（PC） ；高效液相色谱 -质谱Abstractheavy metals is known as one of environmental pollutants, in recent years, the development of industrials, the use of pesticides, fertilizers, makes the heavy m
4、etals in the aquatic and soil pollution becomes more and more serious, and heavy metals are accumulated in the plant organs, the finally, human is persecuted by heavy metals through the food chain.Using plants to reduce heavy metal pollution is a hotspot of research and development at home and abroa
5、d. The study found that cadmium absorbed by the body will turn into cadmium sulfide protein, cadmium sulfide is a selective protein, can be accumulated in kidney, a third of the cadmium can be absorbed by the kidney, the kidney is the target organ of cadmium poisoning. Other organs such as pancreas,
6、 spleen, thyroid gland and hair also be accumulated a certain amount. Cadmium in the body will be united by protein molecules containing amino, hydroxyl, inhibition of many enzyme system, so that the normal function of the liver and kidney organs in enzyme system will be damaged. Due to the cadmium,
7、 the patient can appear the symptom of diabetes, protein and amino acid urine, More seriously, which can make bone metabolism, cause osteoporosis, contraction and a series of symptoms, the harm of cadmium has been greatly concerned.In this study, Chelating peptide content in plants was used as an in
8、dex, which explored the influence that different concentrations of cadmium induced the content of peanut plant chelating peptide, the study use peanuts grown in different heavy metal chromium as raw material and take advantage of high performance liquid chromatography-mass spectrometry instrument to
9、 determine the content of peanut plant in chelating peptide.This experiment took advantage of reversed phase column C, acetonitrile and 1.5% trifluoroacetic acid, which detected the chelating peptide content of peanut under The induced of different concentrations of cadmium. In the above experimenta
10、l conditions, the detection limit was 0.25 mg/L; distribution of the linear range was 0.60 -0.25 mg/L (R2 = 0.9988), and between the recovery rate was over 80%, relatively high sensitivity. Choosing the way of peanut chelating peptide was found quantitative analysis. The results showed that the Pean
11、uts polluted by heavy metal cadmium were detected with different concentration of plant chelating peptide.The purpose of the study was to do a contribution for heavy metal cadmium pollution reduced.Key words：Cadmium pollution; Peanuts; Plant chelating peptide (PC); High performance liquid chromatogr
12、aphy - mass spectrometry目录序言 10.1 植物螯合肽( PC)的简介 10.2 植物螯合肽( PC)的合成 10.3 PC 对重金属的解毒作用 3第 1 章 实验材料及实验方法 51.1 实验材料、试剂及仪器 51.2 实验方法 5第 2 章 实验结果与分讨论 72.1 PC 标准样品混合物的色谱分离 72.2 镉对花生体内 PC 和 GSH 含量和 PC 状态的影响 72.3 花生样品中 PC4 的含量检测 8第 3 章 实验结论 123.1 实验结论 123.2 研究展望 12参考文献 13致谢 14序言0.1 植物螯合肽( PC)的简介 0.1.1 PC 的种类
13、植物螯合肽（PC phytoehelatin） ，是在重金属诱导下，植物通过一个富含半胱氨酸的多肽的酶催化合成的一种巯基含量特别高蛋白质。研究表明 PC 由 Glu、Cys 、 Gly 三种氨基酸组成，分子量位于 1.5-4KD 之间。研究表明 PC 最初是在用 200 mMol/LCdSO4 诱导蛇根木悬浮细胞时发现的，目前人们已经发现了 5 种带有不同的C-末端氨基酸种类的 PC，分别是：（ -谷氨酸-半胱氨酸） n-Gly，(-谷氨酸-半胱氨酸）n-Gly ， （ -谷氨酸-半胱氨酸）-Ala， （- 谷氨酸-半胱氨酸）n-ser 和（-谷氨酸-半胱氨酸）-n。0.1.2 PC 螯合重金
14、属的原理植物螯合肽对重金属离子具备很强的螯合能力，因此在重金属的积聚与解毒过程当中起着决定性功能。其机理是：重金属离子植物吸收到体内后，与细胞内的 PC 作用构成复合物， 而后转运到特定的细胞器 ( 特别是液泡 )，然后区室化络合，降低细胞质中有毒的金属离子的浓度。0.1.3 PC 的测定方法PC 的测定方式包含高效液相色谱-氨基酸主动分析联用法、前衍生反相高效液相色谱荧光检测法、电化学法、 电泳法。其中，柱前衍生液相色谱荧光法的优点是能测定不同种类的 PC，但是衍生试剂难购买到，并且衍生过程复杂；电化学法和电泳法可测定总的 PC，但不能确定不同作物的 PC 的类型；而高效液相色谱-氨基酸自动
15、分析联用方式难达成；高灵敏度液相色谱-质谱法，具有分离率高，可在多肽复合物测定 PC 结构鉴定等优点，成为 PC 的主要测定方法。0.2 PC 合成Salt 等研究者将植物对金属的解毒机制分为生物转化、细胞修复作用、区室化作用、螯合作用这四个方面。螯合效应是指在植物中的 PC 利用高亲和力螯合金属离子，金属浓度降低后，植物重金属毒性有所削弱。螯合作用是指植物中的重金属经过与 PC 这种高亲和力物络合成螯合物从而使重金属离子在植物体内的浓度降低，削弱其毒性。0.2.1 PC 的合成需要金属离子的诱导PC 的合成可被金属离子激活，因为酶的活性能被金属离子诱导。当植物组织液、细胞生长介质或酵母培养液
16、中加入微量重金属元素时，即可诱导细胞产生少量PC，其中 Cd2+对 PC 的影响最大。曾有学者用实验测定了金属离子对 PC 的合成的诱导能力比较，结果显示其中 Cd2+对 PC 合成的影响最大，同时Ni2+、 Cd2+、Cu 2+、Hg 2+、Ag +、Sn 2+、Zn 2+、Sb 3+、P 2+、Au +均可诱导 PC 合成，然而将激活剂金属离子浓度降低或者是外加金属螯合剂( 例如 EDTA)时，PC 的合成就会被迫停止，这说明 PC 生物合成需要金属离子的诱导，同时实验表明不同金属对 PC 诱导作用在不同种植物中有不同的强度。0.2.2 PC 是以谷胱甘肽(GSH)为底物的酶促反应关于 G
17、SH 合成 PC 的过程，研究者普遍认为按一下方式进行的：- ATP - -ATP- -图 1.1 PC 的生物合成过程半胱氨酸：Cys ；谷氨酸： Glu；甘氨酸：Gly；谷胱甘肽：GSH 谷胱甘肽酶：GS；-谷氨酰半胱氨酸合成酶：GCS；植螯合肽：PC；植物螯合肽合成酶：PCS 第一步 -GCS 使用 ATP 把 Cys 和 Glu 连接成 - Glu- Cys，再由 ATP 供应能量，谷胱甘肽合成酶（GS）在 -谷氨酸- 半胱氨酸连接甘氨酸残基，从而合成一个 -谷氨酸- 半胱氨酸甘氨酸分子即 GSH，植物螯合肽合成酶（植物 chelatin 合成酶，PCS） N 端具有有源区和信号区，没
18、有 Cd2 +的存在时， C 端检测领域不会触发信号，则 N 端的激活结构域的酶就无活性；而当溶液中有 Cd2+时，信号检测域感受到Cd2+，与 Cd2+、Cys 连接构成特别的空间结构，使酶的 N 端区域拥有催化活性。在这个地区，一个分子的 PC 合酶催化另一种分子 GSH 合成 PC2，PC2 可以继续被Glu+Cys -Glu-Cys+Gly-GCSGSHGS PCS+ Cd2+PCGSH 催化，使 PC3 进一步合成。0.3 PC 对重金属的解毒作用0.3.1 PC 可提高植物对重金属的抗性斯特芬和其他科学家在 1986 年使番茄品种细胞用足以致死的浓度处理，获得了抗 Cd2+的细胞，
19、获得的抗性细胞中，植物螯合肽的累积量远远高于正常细胞， 但随着 -谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂 BSO（丁亚磺酰亚胺）作用于 Cd2+抗性细胞之后，其又恢复了对 Cd2+的敏感性，所以他们认为 PC 含量与细胞对 Cd2+的抗性有关，做了不同植物的实验得到的结果是一样的。研究人员发现，吃蘑菇的美味牛肝菌（牛肝菌）通过 PC 螯合 Cd（Collin 汉森 2007） ，当线虫 cepcs3 和烟草耐 Cd 能力改进以后，胞浆中 PCCD 所占的比重也增加了。许多试验表明，随着镉浓度的增加，镉螯合肽细胞数量也增加，高分子螯合肽含量也增加，这些研究表明，PC 可以减轻镉的毒性作用，越来越多的研究表明
20、，PC 不仅可以缓解重金属镉对植物的毒性作用还可以提高对重金属镉的抗性。0.3.2 PC 解除重金属的毒害作用机理植物螯合肽的功能主要是通过络合重金属与将重金属区室化来减轻重金属对细胞的毒害，多数金属离子都能被 PC 络合，但是研究较清楚的是植物螯合肽与金属Cd 的络合机制，并且日前分离出的 PC 大多是 PC-Cd 型复合物。Howden 等从被 Cd2+诱导的植物中分离出两种 PC-Cd 复合物，一种是硫含量低的 Pc-Cd 复合物和含硫量高的 pC-CdS 复合物，它们均是可溶性化合物，硫含量低的 Pc-Cd 是 Cd2+ 的运输载体，大多数在细胞质中；硫含量高的 pC-CdS 是液饱中
21、Cd 2+存在的主要方式。植物对 Cd2+解毒方法可以分为硫含量低的 Pc-Cd 复合物的跨液泡膜转运、硫离子在液泡中的累积导致的含硫量高的 pC-CdS 形成这两种方式。当 Cd2+进入到细胞后， PC 合酶与 Cd2+形成硫含量低的 Pc-Cd 复合物，它在重金属转运蛋白 hmtl( heavy metal toleranee)（位于液泡膜上）的帮助下进入到液泡里面，接着和液泡中的 Cd2+、硫化物结合形成毒性较低的 HMW，从而解除了 Cd2+的毒性。研究还发现在酸性环境下，液泡中的 HMW 复合物上的金属离子还能和柠檬酸、苹果酸相结合，失去金属离子的 PC 分解成形成氨基酸，又返回细胞
22、质中参与 PC 的合成。见图 1.2图 1.2 PC 解除重金属的毒害作用机理示意图第 1 章 实验材料和实验方法1.1 实验材料、试剂及仪器该实验所用的实验试剂有：三氟乙酸（分析纯，沈阳新纪化学公司） ；乙腈(色谱纯，沈阳新纪化学公司 )；(- G l u-Cys) 4- A la( 北京盛科博源生物科技有限公司) ；PC 标准品（纯度 97%的丙氨酸类植物螯合肽 PC4 )；去离子水；花生。该实验所用的实验仪器有：配备二极管阵列检测器；色谱仪 (美国公司 )；单极质谱联用仪 (美国公司 ) ； 有 50mm、1 mm、 3.5mm 规格的 C18 色谱柱（美国公司) ，配有电雾化学源，质谱
23、工作站。1.2 实方法验1.2.1 花生样品的处理 花生种植后，样品被粉碎，利用索氏提取脱脂，脱脂干燥后是一种粗蛋白粉，称 0 .6-2.5 g 蛋白粉末。1.2.2 花生中 PC 的提取根据 sneller（2000）的方法，把花生鲜样用液氮在研钵中磨碎，然后冷冻干燥达 70 小时，冷冻干燥以后称量约 0.1g 的花生，再加入 7mL 的 0.1% TFA（含6.3mmol/LDOTA，PH1)，充分振荡 30min ，然后 4 度下， 在约 10000 r/m in 离心率下离心 20 m i n ，吸取上清液以备待测用。1.2.3 巯基化合物标准品的配制选用 0.1% TFA(含 6.3
24、mmol /L 的 LDTPA) 制成 4 种巯基化合物贮备液，浓度均为 1mmol /L 的，分别为： Cd- PC 标准品（(美国 Waters 公司） ，Cys 和 GSH 备用液，置于 4冰箱保存。1.2.4 花生中 GSH，PC 等总含量的测定 配置含 1.6 mmol /L 的埃尔曼试剂试剂显色剂(含 6.3 mmol /L 的 DTPA)的 200 mmol /L 的 HEPPS 缓冲液（pH = 7.6） ，避光保存，取花生组织提取液 300 L 加到300L DTNB 显色剂中，混匀后在 30下反应 3 min，其中 GSH，PC 和 TNB 会发生反应，生成黄色化合物，非蛋白巯基化合物与黄色化合物含量符合 1:1 的比例关系，依据有差别的花生样品在 420 nm 下的吸光度值不同，便可计算出花生样品中巯基含量。
