1、山西农业大学硕士研究生毕业论文HIV-1 跨膜蛋白 gp41 核酸疫苗的构建及其免疫原性研究研究生姓名： 辛 苏 文导 师： 马 海 利教 授金 宁 一 研究员学 科专 业： 预 防 兽 医 学研 究 方 向 ： 动 物 传 染 病 诊 断 与 防 治中国山西太谷2007 年 6 月The Construction and Immunogenicity of Transmembrane Protein gp41 Nucleic Vaccine of HIV-1Graduate name : Xin SuWenGraduate tutor : Prof. Ma hailiResearcher.j
2、in ningyiSubjectMajor: preventive veterinary medicineResearch subject: the diagnosis and prevention of animal infectious diseases TaiGu ShanXi ChinaJune, 2007目 录摘 要 .2前 言 .3材料与方法 .101 试验材料 .102 试验方法 .122.1 基本实验操作方法 .122.2 重组质粒的构建 .162.3 重组质粒转染哺乳动物细胞 .17结果与分析 .191 重组质粒的酶切鉴定 .192 重组质粒表达 gp41 的检测 .193
3、ELISA 检测特异性抗体 .204 T 细胞亚群数量的检测 .21讨 论 .22结 论 .28Abstract .32致 谢 .332 摘 要人免疫缺陷病毒是引起获得性免疫缺陷综合症的病原体，其感染及引起的疾病对卫生组织保健资源和世界经济影响非常巨大。因此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义。gp41 是镶嵌于 HIV-1 脂质双层中的一种跨膜蛋白, 是 HIV-1 的主要免疫原之一，在病毒感染过程中能够介导病毒脂膜与细胞膜的融合。因此，gp41 已成为抗 HIV 理想的药靶，其基因是研制 HIV 核酸疫苗理想的靶基因。本研究利用分子生物学、免疫学等 实验技术和手
4、段进行了 HIV-1 跨膜蛋白 gp41 核酸疫苗的构建和实验性免疫学研究。首先用 PCR 法获得 gp41 全基因，然后将其克隆到真核表达载体 pIRES 中，构建重组质粒 pIRES-gp41。将此重 组质粒转化感受态，酶切 鉴定正确后，将其 转染 BHK-21 细胞，结果表明能成功表达了 gp41 蛋白。小鼠免疫试验结果显示其具有良好的免疫原性，既可刺激小鼠产生体液免疫，同 时又可以刺激小鼠产生细胞免疫。总之，本研究利用先进的实验技术和手段，构建了 HIV-1 核酸疫苗， 为开发新型 HIV疫苗甚至进一步进入临床研究奠定了基础。关键词：HIV；核酸疫苗；gp41；pIRES；转染；表达3
5、 前 言人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）是引起获得性免疫缺陷综合症（AIDS ，即艾滋病）的病原体。艾滋病自 1981 年首次发现以来一直以惊人的速度在全球蔓延，至今人类仍然没有找到治疗艾滋病的有效方法。HIV 通过使人体 CD4+ T 细胞数量的进行性减少，细胞免疫功能的损害，最后导致的各种机会性感染、特殊的恶性肿瘤发生和中枢神经病变等 1。当前，对艾滋病的研究主要集中在预防 HIV-1 感染疫苗的开发和对艾滋病患者病情的控制。通常认为 HIV 作用的主要靶细胞为淋巴细胞和单核巨噬细胞，经吸附、融合过程后进入宿主细胞。HIV 基因组 RNA
6、 经逆转录酶转录成前病毒 DNA，在细胞核内再被整合酶整合进入宿主基因组，利用宿主细胞已有的基因复制和蛋白表达系统进行复制。在 19 世纪中叶，该病毒突破了猿猴和人类的种间屏障在人和猿类中实现了交叉感染。由于不安全的注射和输液，使其在人与人之间发生感染流行。从而使病毒在经历数代繁殖后适应了人体的环境。今天，该病在非洲成为了头号杀手，在世界上则被列为第四大致死性疾病。HIV 感染及引起的疾病对卫生组织保健资源和世界经济影响非常巨大2。因此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗用于健康人群和感染者具有重要的现实意义。1 HIV/AIDS 的流行情况艾滋病是人类健康和全球公共卫生的最重大挑战
7、，严重危害社会进步与经济增长。世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在 2005 年底公布，目前全球存活艾滋病和 HIV 感染者(HIV/AIDS)总人数已超过 4000 万，已死亡艾滋病病人累计超过了 3 000 万名。 据统计联合国艾滋病规划署和世界卫生组织 2006 年发表的年度全球艾滋病疫情报告显示 3，全世界的艾滋病感染人数今年又创新高，突破 4030 万人，其中 95%的人生活在世界欠发达地区。撒哈拉沙漠以南 16 个国家仍是艾滋病感染最严重的地区，感染率超过 25，其中15 岁以下的儿童患者达到 6%。艾滋病在以惊人的速度蔓延着，现在每天有 16000 人感染
8、上艾滋病，也就是说平均 56s 就有 1 人感染艾滋病 4。进入 90 年代后，亚洲已成为疾病传播最快的地区之一，目前全球四分之一的新增病例出现在亚洲，亚洲目前正处于控制艾滋病蔓延的关键时刻。在中国，截止 2006 年10 月 31 日，累计报告艾滋病 183733 例，其中艾滋病病人 40667 例，死亡 12464 例，4 并且还有增长的趋势，其状况非常令人担忧。中国艾滋病感染人数每年以 30%的速度增长，所面临的形势相当严峻，全人群感染率约 0.07。我国 31 个省、自治区、直辖市都发现了艾滋病病毒感染者，遍布社会各阶层，据统计，内地艾滋病感染者将达到 300万人，即每四百人中就有一名
9、艾滋病带菌者。我国艾滋病流行情况比较复杂，入侵我国的艾滋病病毒类型有两个 HIV-1、HIV-2，两个病毒类型间还有混合，防治工作及相关科研工作更需尽快展开。2 HIV 的结构HIV 隶属于逆转录病毒科（ Retroviridae）慢病毒属（ Lentivirus） 5，成熟的HIV 病毒为球形颗粒，直径为 100200nm。外壳由嵌有膜蛋白的脂质双层膜构成，电镜下可见一个外包病毒囊膜的 20 面体结构，囊膜表面有 72 个规则排列的突起。这些突起由外膜 gp120 蛋白和跨膜 gp41 蛋白组成，外膜蛋白 gp120 的球状物突出于病毒包膜之外，另一端贯穿病毒包膜与运转蛋白 gp41 相接。
10、HIV 病毒的内层为蛋白质(结构蛋白)，内核也由结构蛋白组成。病毒粒子的中央为一个呈锐头致密的圆锥形核心，由核蛋白包裹的基因组 RNA 和病毒酶组成。病毒核心中含有两个单股 RNA 基因组和 Mg2+依赖性逆转录酶和 DNA 聚合酶。HIV 可分为 HIV-1 和 HIV-2 两个型，前者是引起爱滋病的主要病原体。HIV-1 的亚型分为 M 亚型组、O 亚型组和 N 亚型组。HIV-2 的生物学特性与 HIV-1 相似，但毒力较弱，引起 AIDS 病程较长，症状较轻。HIV-2 与 HIV-1 核苷酸的同源性仅有 45%。HIV-1 和 HIV-2 基因变异率很高，它们的分离株彼此都不相同，这
11、是由于病毒基因的突变、插入、缺失和不同病毒株之间的基因重组引起的。这两型病毒都引起相同的临床症状，但 HIV-2 的致病力较低。根据 HIV-1 感染细胞种类将病毒分为：巨噬细胞噬性病毒(M.tropic) 、T 细胞噬性病毒( T. tropic) 和双重噬性病毒(Dual.tropic)。M. tropic 是无症状患者携带的主要病毒，主要利用 CCR5，又称为 R5 病毒株，在病毒传播中起主要作用。T.tropic 主要利用的辅助受体为 CXCR4，又称为 X4 病毒株，Dual.tropic 既可利用 CCR5，又可利用 CXCR4，被称为 R5X4 病毒株。HIV 基因组为两条相同的
12、单股正链 RNA，两单体由氢键组合成二聚体。HIV-1 基因组长约 9.3kb，HIV-2 基因组长约 9.7kb。基因组的 5端有帽结构，3端有 Poly(A)尾，两端具有逆转录病毒的基本结构基因 LTR（长末端重复序列），中间有 9 个开放读码框架（ORF），3 个结构基因，即编码核心蛋白的 gag；编码外膜蛋白的 env；编码病毒复制所需逆转录酶、整合酶、蛋白酶的 pol。HIV-1 还有 2 个调节基因 tat、rev 和4 个附属基因 nef、vif、vpr 和 vpu，分别编码相应的蛋白 5。5 （1）gag 基因能编码约 500 个氨基酸组成的聚合前体蛋白（P55），经蛋白酶水解
13、形成P17、P24 核蛋白，使 RNA 不受外界核酸酶破坏。（2）Pol 基因编码聚合酶前体蛋白（P34），经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶 H，均为病毒增殖所必需。图 1 HIV 结构示意图图 2 HIV 基因组结构（3）env 基因编码约 863 个氨基酸的前体蛋白并糖基化成 gp160、gp120 和 gp41。已证明 HIV 中和抗原表位在 gp120 V3 环上，V3 环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120 不含有穿膜区，它通过与 gp41 的非共价结合而保持与细胞表面的结合状态，当 gvp120 与 CD4+结合后，其构象改变与 gp41
14、 分离，暴露出的 gp41 可插入细胞膜，由于膜融合，致使病毒核心被导入细胞。这两种分子对病毒感染是至关重要的。gp41 与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明 gp41 有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。（4）TaT 基因编码蛋白（P14）可与 LTR 结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒 mRNA 的翻译。6 （5）Rev 基因产物是一种顺式激活因子，能对 env 和 gag 中顺式作用抑制序列(Cis-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用，增强 gag 和 env 基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。（6）Nef 基因编码蛋白
15、P27 对 HIV 基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于 HIV cDNA 的 LTR，抑制整合的病毒转录。可能是 HIV 在体内维持持续感染所必需。（7）Vif 基因对 HIV 并非必不可少，但可能影响游离 HIV 感染性、病毒体的产生和体内传播。（8）VPU 基因为 HIV-1 所特有，对 HIV 的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。（9）Vpr 基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。HIV-2 基因结构与 HIV-1 有差别：它不含 VPU 基因，但有一功能不明的 VPX 基因。核酸杂交法检查 HIV-1 与 HIV-2 的核苷酸序列，仅 40%
16、相同。env 基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。3 机体对 HIV 感染的免疫应答人体的免疫系统是抗外部感染的最后防线，许多病原体感染人体，最终通过人体的细胞免疫和体液免疫而消灭。HIV 感染能激发机体产生特异性的细胞免疫反应和对各种病毒抗原产生相应抗体。如 HIV 感染后可刺激机体产生囊膜蛋白（gp41、gp120）抗体和核心蛋白（p24）抗体 6，7 。这种抗体可在 HIV 携带者及艾滋病病人的血清中检测到，说明该抗体在体内有保护作用。HIV 感染者可产生 T 淋巴细胞的细胞毒作用，如在感染脑部发现有 T 淋巴细胞浸润，说明 T 淋巴细胞在 HIV 感染中发挥抑制病毒复制的作用 8
17、。机体产生的抗体可以中和游离 HIV 病毒及已和细胞结合而未进入细胞内的 HIV 颗粒。自然杀伤细胞和杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性作用能溶解和杀伤 HIV 感染的细胞。机体的细胞免疫和体液免疫作用可在一段时间内控制 HIV 的复制及扩散。但是，由于病毒的变异和重组，可以逃脱免疫监视，不能被机体的免疫系统彻底清除。当机体的免疫系统被进一步破坏时，在某些触发因素的作用下，使 HIV 大量复制和扩散，最终导致艾滋病的发生 9。 4 HIV 入侵 细胞的机制 HIV 病毒为逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的单链模板中。该病毒能结合人类具有 CD4+受体的细胞，还能与神经表面的半乳糖神经酰胺结合，逆
18、转录酶可将病毒RNA 逆转录为 DNA，然后 DNA 再与人类基因相整合。病毒 DNA 序列被感染细胞及其7 子代细胞终身携带。HIV 进入人体后能选择性的侵犯有 CD4+受体的淋巴细胞，以 CD4+ T 淋巴细胞为主。病毒感染 CD4+ T 淋巴细胞后，首先引起细胞功能的障碍，细胞因子产生减少。当病毒在宿主细胞内大量繁殖时，导致细胞的溶解和破坏。HIV 在细胞内复制后，可引起细胞膜的损伤，它可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞病变。HIV 还可以感染骨髓干细胞导致以 CD4+ T 淋巴细胞减少。当 HIV 感染的 CD4+ T 淋巴细胞表面存在的 gp120 发生表达后，它可
19、以与未感染的CD4+T 淋巴细胞 CD4+结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜的通透性，引起细胞的溶解和破坏 10。gp41 透膜蛋白能抑制有丝分裂原和抗原刺激淋巴细胞的增殖反应，从而使CD4+T 淋巴细胞减少。HIV 感染后一般先出现 CD4+ T 淋巴细胞轻度至中度降低，该细胞总数可持续数年不变，反应病毒被免疫应答所抑制，历经一段时间，CD 4+ T 进行性减少，当病毒逃脱免疫抑制时可导致机会性感染和肿瘤的出现，以 CD4+ T 淋巴细胞数量及功能的进一步下降为特征 11，当减少到一定程度，就会出现机会性感染。5 HIV 药物和疫苗的研究现状2004 年全球艾滋病感染人口总数达历史最高，艾滋
20、病疫苗和药物的研发无疑具有极其重要的意义 11。艾滋病药物研制则已从核苷酸类抗病毒药物发展到逆转录酶制剂和蛋白酶抑制剂复方制剂，加强我国自主研发艾滋病中药药物已迫在眉睫。 高效抗病毒联合疗法（HAART）已显著降低 HIV-1 感染的发病率、死亡率及机会性感染的频率。然而尽管 HAART 能长期持续的抑制病毒的复制，最大限度的减少了循环病毒的水平，使 CD4+ T 淋巴细胞数量缓慢回升，但外周血 CD4+ T 淋巴细胞数量不能达到正常水平，长期存活的潜在感染的细胞仍存在。一旦中断这种药物治疗，将会出现血浆病毒的反弹，而且这种药物相当昂贵。由于药物的弊端和耐药株的产生影响艾滋病的治疗，所以预防
21、HIV 传播的最佳措施是研制安全而有效的预防性疫苗 12传统的疫苗一般是被杀死的病原微生物或是毒力被减弱的病原微生物制成。但这些疫苗具有很大的弊端。虽然接种灭活疫苗的动物可以不发展成艾滋病，但是并不能保护接种动物免受野生型病毒的再感染。并且该疫苗在安全性上存在问题，由于残留的 HIV核酸可能具有感染性，作为免疫原接种于人，危险性很大。而且灭活苗诱导机体产生的主要为体液免疫，对那些寄生于机体细胞内部的病原微生物无作用。虽然减毒 HIV 活疫苗 13，14 既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫，但组成减毒活疫苗的病毒株在免疫功能正常的人群中可以诱导对机体有利的免疫应答，而在某些免疫8 功能低下的人群
22、，如艾滋病患者及接受化疗的癌症患者，这些原本安全的病毒株可能会引起感染的发生。而且某些病毒株会通过基因突变的方式恢复完整的毒力，从而对机体造成伤害。此外，病原微生物表面的抗原分子种类繁多，若其中某些分子恰好与人体细胞表面的某些分子结构相同，那由此引发的免疫应答在杀伤病原微生物的同时还可能会杀伤正常机体细胞，产生自身免疫反应，同样对机体造成伤害。另外，病毒的突变或缺失会导致他们保护效率减弱。由于传统疫苗的不足之处，科学家们一直致力于研制新型的 HIV 疫苗，如重组亚单位疫苗 15、重组活载体疫苗等 16。目前研究的新型疫苗有以下几种：（1）亚单位疫苗包括纯化的病毒蛋白和重组的病毒蛋白，后者是将编
23、码病原体的抗原蛋白基因与质粒拼接后插入细胞宿主，由宿主产生具有抗原活性的蛋白，经抽提纯化后成为基因工程亚单位疫苗，也称重组亚单位疫苗。常用的细胞宿主为大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞。蛋白亚单位疫苗也是艾滋病疫苗研究的重点方向之一，已知 HIV-1 基因编码的各种蛋白产物大都有免疫原性，其中研究最多的是 HIV 膜蛋白（Env 蛋白） ，这是因为此蛋白暴露在病毒颗粒表面，对免疫系统是很强的刺激原，所以，以重组膜蛋白为基础的亚单位疫苗一直是艾滋病疫苗临床试验的主角，但此类疫苗的缺点是基本不能引起机体产生细胞免疫。美国 VaxGen 公司和美国军队于 1999 年 4 月用此类疫苗在美国和泰国开始进行
24、 3 期临床试验。2003 年 2 月，VaxGen 公司宣布，他们研制的 AIDS VAXgp120 苗在历经 3 年的 3 期临床试验后，不能有效地预防 HIV 对人体的感染，最终宣告失败。但有关专家认为，其教训对发展新一代疫苗也是很有意义的。（2）活载体疫苗应用重组载体制备疫苗是目前HIV疫苗研究的热点。从免疫学的角度看，重组载体疫苗是一种比较理想的疫苗系统，将含HIV 抗原决定簇的基因插入其它病毒或细菌的基因组中，利用这些病毒或细菌与相应的细胞表面受体的作用，将HIV抗原基因送入细胞，可以使这些基因的表达产物与MHC-I类分子或MHC-类分子结合，更好地呈递给免疫系统，同时用作载体的病毒或细菌本身可以作为佐剂加强免疫。（3）DNA 疫苗HIV 变异率很高，是疫苗研究的极大障碍。DNA 疫苗的优点是可以对变异迅速的病原微生物提供交叉防御的作用，有助于克服由于病毒的变异而逃避免疫反应的问题。核酸疫苗与传统疫苗的区别主要是核酸疫苗的抗原蛋白是免疫对象体内产生的，表达产物具有天然的构象，可按照正常的途径加工、修饰，再提呈给免疫系统，最终引起全面的免疫反应，整个过程与病毒的自然感染或接种减毒活疫苗相同，它的最大优点是具有
