1、本科毕业论文论文题目：木霉 LTR-2 菌丝多糖提取和单糖组成分析学生姓名： 刘帅帅 学 号 ： 201001030225 专 业 ： 化学工程与工艺 指导教师： 刘名礼、郭凯 学 院： 化学化工与材料科学学院 2014 年 5 月 20 日论文（设计）题 目木霉 LTR-2 菌丝多糖提取和单糖组成分析选题时间 2014 年 3 月 完成时间 2014 年 5 月论文（设计）字数9437关 键 词 哈茨木霉 LTR-2；多糖； 响应面分析；高效液相色谱法；单糖论文（设计）题目的来源、理论和实践意义：选题实验室已经完成了薄荷和杏鲍菇中多糖的提取，结果证明薄荷多糖具有显著的缓解炎症的效果，而杏鲍菇
2、多糖可以很好的提高小鼠的免疫活性。哈茨木霉 LTR-2 作为生防菌剂已被广泛应用于农业生产中，主要防治植物病害并促进植物生长发育。其多糖的研究还未有开展，本研究的多糖提取方法和单糖组成测定基于本实验室已有的实验平台，可以有效快速的摸索适合哈茨木霉菌丝多糖提取和单糖分析的工艺。通过优化木霉菌丝中多糖提取工艺，并通过高效液相色谱分析木霉提取多糖中的单糖组成，以确立木霉属真菌中多糖的最优提取方法，同时鉴定木霉菌丝中多糖的单糖组成比例。论文（设计）的主要内容及创新点：首次对木霉属真菌的多糖提取方法进行研究；首次鉴定木霉菌丝中多糖的单糖组成和比例。附：论文（设计） 本人签名： 年 月 日木霉 LTR-2
3、 菌丝多糖提取和单糖组成分析摘 要：木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目 ，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）是木霉菌中具有重要经济意义的一种，目前在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。哈茨木霉能产生多种具有生物活性的酶系，又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。针对木霉菌丝干样多糖的提取, 通过单因素实验选取实验因素与水平, 根据Box Benhnken 的中心组合实验设计原理, 在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析法, 依据回归分析确定各工艺条件的影响因子, 以多糖提取率为响应值作响应面和等值
4、线图。 结果表明, 木霉LTR-2多糖水浸提取的最佳工艺条件为：提取温度为90，提取时间为98.28min，料水比为1:55.12； 在该工艺条件下多糖的提取率达9.26244 %，该工艺可用于指导生产实践。然后又进一步利用柱前PMP衍生高效液相色谱法分离分析单糖组分。关键词：哈茨木霉 LTR-2；多糖； 响应面分析；高效液相色谱法；单糖。Trichoderma viride LTR - 2 mycelial polysaccharide extraction and monosaccharide composition analysisAbstract: Trichoderma is a k
5、ind of common fungus, which belongs to the Deuteromycotina, Hyphomycetes, Moniliales and stick spore fungus. Trichoderma harzianum is a kind of important economic significance, at present, it has a wide range of applications in industry, agriculture and environmental science and so on. Trichoderma v
6、iride can produce many kinds of bioactive enzyme system, and it is a resource-rich antagonistic microorganisms. Now it plays an important role in biological control in plant pathology.In view of the polysaccharide extraction of the dry sample of trichoderma hypha, by single factor experiment selecte
7、d factors and levels, according to the principle of the centre of the Box Benhnken combination experimental design, on the basis of single factor experiment using three factors three levels of response surface analysis and based on regression analysis to determine the effects of process condition fa
8、ctor, we construct the response surface and contour map with polysaccharide extraction yield . The results show that Trichoderma viride LTR - 2 optimum process conditions of polysaccharide from water is: extraction temperature is 90 , the extraction time is 98.28 min, the ratio of material to water
9、is at 1:55. 12; Under the condition of the technology of extraction yield of polysaccharide is 9.26244%, the process can be used to guide the production practice. Then a simple and sensitive HPLC(high Performance liquid chromatographic method) for simultaneous determination of kinds of neutral monos
10、accharides by Pre. Column derivatization with PMP (l-Phenyl-3-metllyl-5-Pyrazolone) has been used.Keywords: Trichoderma harzianum LTR - 2; Polysaccharides; The response surface analysis; HPLC; Monosaccharides.目录摘 要 .IAbstract.II1.前言 .11.1 木霉简介 .11.2 热水浸提法 .21.3 单因素分析法 .21.4 响应面分析法 .21.5 PMP 柱前衍生高效液相
11、色谱法分析单糖组成 .31.6 实验目的和意义 .32.多糖提取 .52.1 实验材料 .52.2 实验试剂 .52.3 实验仪器 .52.4 单因素实验 .52.4.1 配制 PDA 培养液 .52.4.2 制得样品 .62.4.3 单因素实验 温度 .62.4.4 单因素实验 取样时间 .62.4.5 单因素测量 料水比 .72.5 响应面分析实验 .73.单糖分析 .93.1 材料与仪器 .93.2 实验方法 .93.2.1 样品的全水解 .93.2.2 单糖标准品溶液的配制 .93.2.3 样品和标准品的 PMP 衍生 .93.2.4 HPLC 分析 .104.实验结果和讨论 .114
12、.1 单因素实验测定结果 .114.1.1 最佳提取温度 .114.1.2 最佳提取时间 .114.1.3 最佳料水比 .124.2 响应面分析法对最佳提取时间的测定结果 .134.2.1 响应面分析实验结果 .134.2.2 回归模型方差分析 .134.2.3 模型交互项的解析 .144.2.4 最优条件预测及验证 .184.3 单糖分析结果 .184.4 讨论 .205. 结论 .21参考文献 .22致 谢 .241.前言1.1 木霉简介哈茨木霉菌株 LTR-2，保藏号为 CGMCC NO.1498，特征描述如下：菌落在 PDA 平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期
13、因产生分生孢子而呈深绿色，产孢区常排列成同心轮纹状，菌落背面无色，有时呈浅黄色，菌丝透明，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分枝多，对生或互生二至三级分枝，整体象树枝；分枝与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶形，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，或者布满小刺突；单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。木霉菌作为生防菌株已得到广泛认可，其对植物病原真菌的拮抗作用包含多种机制，一般认为有竞争作用、重寄生作用及抗生作用。Harman 1认为，在木霉的生防机制中可能还包括：(1)在非生物胁迫的逆境下，通过加强根系和植株的发育提高耐性；(2)可诱导植物对病菌的抗性；(3)增加
14、土壤中营养成分的溶解性，并促进其吸收；(4)使病原菌的酶钝化。此外，近年来一些报道指出木霉菌还能提高宿主植物耐受非生物胁迫的能力 2。哈茨木霉是木霉菌中具有重要经济意义的一种，目前在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。哈茨木霉在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上 3。哈茨木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。所产生的纤维素酶的降解作用，目前日益受到重视，国内外对这方面的研究也很多。同时，哈茨木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。随着转基因技术的不断成熟，哈茨木霉在基因工程上的应用，逐渐引起人们的关注 4。哈茨木霉
15、是所产纤维素酶活性最高的菌株之一。哈茨木霉产生的纤维素酶能将植物纤维素分解为葡萄糖，能破坏植物细胞壁，使其释放蛋白体、淀粉等营养成分，能消除饲料中淀粉多糖的抗营养作用，提高饲料利用率和畜禽生产性能 5。哈茨木霉是一种资源丰富的拮抗微生物，在植病生防中具有重要的、不可忽视的作用。它的作用机制有以下几种：产生抗生素；重寄生作用，这是木霉菌作为拮抗菌最重要的机制；溶菌作用；竞争作用（主要为对生存空间和营养的竞争）。很多研究表明：哈茨木霉的防病机制主要是重寄生作用 。真菌细胞壁的主要成分是几丁质（卵菌为纤维素）和-（13）葡聚糖，还有少量的蛋白质和脂肪。木霉菌在侵入或穿透寄主菌丝细胞时，能产生几丁质酶
16、、葡聚糖酶（包括-（ 13），-（14），-（16）葡聚糖酶）、蛋白酶以及脂酶等一系列水解酶类，来消解病原菌的细胞壁。在这些细胞壁降解酶中，几丁质酶和葡聚糖酶是目前生物防治研究的热点，被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子 6。1.2 热水浸提法热水浸提法是一种非常传统的提取方法,在多糖的提取上应用很广泛。该方法的主要工艺流程是:取原料一组织粉碎一高温下加水做提取一减压蒸馏浓缩一获得粗多糖。热水浸提法优点是:多糖得率比较高,所需提取剂蒸馏水价廉易得、无污染而且可靠安全,因此是一种最为常用的提取方法。1.3 单因素分析法木霉多糖实验的条件很温和，由单因素分析法即只保留一个变量，其他因素均取一
17、个定值，则可分别确定最优提取温度、最优取样时间和最优料水比。在本次试验中，以单因素试验求最佳提取温度为例，温度为变量，取样时间和料水比为一定值。将水浴温度设定为 60、70、80、90、100 五个梯度，而其它两个因素则在其合理范围内取一定值。最后通过实验结果进行分析得到最佳温度。1.4 响应面分析法狭义上说，响应曲面设计方法(Response Surface Methodology，RSM) 是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。试验设计与优化方法，都未能给出
18、直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域。为此响应面分析法 7-8（也称响应曲面法）应运而生。响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型作图。建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法。对于非线性体系可作适当处理化为线性形式。设有 m 个
19、因素影响指标取值，通过 n 次量测试验，得到 n 组试验数据。假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第 k 次试验中第 i个因素的水平值；为建立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差。应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵 B如下将 B 阵代入原假设的回归方程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图。模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面。在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的
20、交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过 n 次量测试验（试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的 3 倍），以 最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为 X 坐标和 y 坐标，以相应的由上式计算的响应为 Z 坐标作出三维空间的曲面（这就是 2 因素响应曲面） 9-16。1.5 PMP 柱前衍生高效液相色谱法分析单糖组成单糖的组成分析是糖分析中的一项重要内容。己有的糖组成分析方法以气相色谱法和高效液相色谱法为主。在单糖分析方法中气相色谱法分离单糖繁琐费时,容易出现色谱峰异构化裂分,而且不能直接得到糖醛酸的信息。高效液相色谱测
21、定单糖 17的方法,常见的有糖分析柱还有氨基键合相柱 18,这些柱子的商品售价非常贵,导致测试成本也水涨船高。1-苯基 -3-甲基-5- 毗吟琳酮 (PMP)柱前衍生化 HPLC19法,现在已经被很多领域使用,它对单糖含量检测很有效,1-苯基-3-甲基-5-毗吟琳酮是用于还原性糖的比较适宜的衍生化试剂,PMP 引入糖结构,可以使原来没有 UV 吸收的糖分子式中在 245-25Onm 范围里,有非常显著的 UV 吸收信号,而且它的产物比较稳定,也不会生成异构体干扰测定。本实验采用 1-苯基-3-甲基-5-毗吟琳酮衍生化法,配合 DADUV 区检测器以及 C18 色谱柱,来全面详细分析木霉粗多糖的单糖组成测定,并达到快速准确,高灵敏度,操作方便安全为目标。1.6 实验目的和意义木霉作为环境友好型植病生防真菌，能有效防治作物病害，促进植物生长、诱导植物产生抗性，在农业和环境保护领域具有重大应用前景。但是我国对于绿色木霉的基础研究报道并不多，研究多集中在纤维素酶活性和生物防治方面，目前国内外对木霉菌在增强植物耐盐性及其作用机理方面缺乏系统研究 20。本次实验通过将哈茨木霉菌丝干料最大程度的水解，摸索出最佳多糖提取条件，如：温度、取样时间以及料水比。然后利用PMP柱前衍生高效液相色谱法对木霉做了单糖成分分析，也对进一步盐胁迫等条件下木霉提取物的改变提供了实验依据。
