1、淮北煤炭师范学院 论文分类号： 2009届学士学位论文 怀菊叶片组织培养技术的研究学院、 专 业 生命科学学院 生物科学 研 究 方 向 植物生物技术 学 生 姓 名 王维维 学 号 200515415148 指导教师姓名 薛建平 指导教师职称 教 授 2009 年 5 月 26 日怀菊叶片组织培养技术的研究王维维（淮北煤炭师范学院生命科学院）（指导教师：薛建平老师）摘要：目的：研究不同植物生长物质 2,4-D,6-BA,NAA,IAA 和不同的接种方式对诱导怀菊叶片分化成愈伤组织的影响，以及研究这四种生长物质对不定芽的分化的影响，最终得出最佳的培养基以及最好的接种方式。方法：将组培苗接种到组
2、合为 MS + 6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L 的培养基上快速繁殖扩大培养。将组培苗的叶片剪切后，以不同的方式接种到附加不同植物生长物质的培养基中，诱导叶片分化为愈伤组织，通过统计方法的计算选出最佳诱导愈伤组织的培养基。再将上组实验中得到的愈伤组织接种于新配制的培养基中，通过观察记录筛选出最佳的诱导再分化的培养基。结论：诱导愈伤组织的培养基组合 MS+2，4-D 2.0mg/L + 6-BA0.1 mg/L+NAA0.2 mg/L,2，4-D 的作用比较明显。最好的接种方式是背接方式，即以叶片的背面接触培养基。最佳诱导再分化的培养基是MS + 6-BA2.0 mg/L + N
3、AA0.5mg/L。关键词：怀菊花；叶片；组织培养；愈伤组织；发芽率Tissue culture technology research of Bosom chrysanthemumWANG Wei-wei(School of life science, Huaibei Coal Industry Teachers College)(Tutored by XUE Jian-ping)Abstract: Objective: To study the influence of plant hormone 2,4-D,6-BA, NAA, IAA and different inoculated
4、ways on inducing the bosom chrysanthemum leaf blade differentiation to callus, thus selected the most suitable medium, As well as studied the influence of 2,4-D,6-BA, NAA, IAA on inducing callus differentiation to bud. Than selected the most suitable medium. Method: The disinfected explants were ino
5、culated onto the MS + 6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L culture medium to propagate more. Then leaves were cut and cultured onto the same kind of media on different sides and different kinds media on the same side, and induced to form callus. And the preferable medium for the callus was chosen. Again the cal
6、lus which were obtained from the former experiment were inoculated onto new medium, through observing and recording to choose the preferable medium for the bud sprouting. Result and Conclusion: The MS medium with 2, 4-D2.0 mg/L+6-BA0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L were much better than others when callus were
7、induced .The main factor which influenced callus differentiation was 2,4-D；The preferable medium for bud sprouting was MS + 6-BA2.0 mg / L + NAA0.5mg/L Key word: bosom chrysanthemum; leaf; tissue culture; callus; rate of bud differentiation目录引言 .11.材料与方法 .11.1 实验材料 .11.2 实验方法 .11.2.1 脱毒苗的快繁 .11.2.2
8、愈伤组织的诱导 .11.2.3 芽的分化 .11.2.4 生根培养与移栽 .21.2.5 参数及分析 .21.3 培养基和培养条件 .22.结果分析 .22.1 怀菊愈伤组织的分化 .32.2 芽的分化 .42.3 生根培养与移栽 .63.讨论 .63.1 菊叶片类型及接种方式对怀菊组织培养的影响 .63.2 植物生长物质对诱导愈伤组织的影响 .63.3 植物生长物质对怀菊的芽分化的影响 .73.4 怀菊叶片直接再生植株 .7参考文献 .8图版 .9图版说明： .10致 谢: .11引言怀菊花属于菊科，产于河南温县一带，是“四大怀药”之一 1。近年来随着药用怀菊花功效的不断验证及其制品的不断研
9、制开发，市场对其数量的要求日益提高，传统的扦插及分株等繁殖方法和靠自然变异的途径已远远不能满足生产上的需要，而且利用这两种方法使得感染病毒严重，目前侵袭怀菊的病毒不下十种，如菊花矮缩类病毒，烟草花叶病毒等，而且随着种植时间的延长病情逐渐恶化，许多优良品种因此丢失，致使产量下降。所以为解决怀菊的病毒病保留优良品种基因，人们主要采用脱毒苗技术。王卉等的实验结果表明用茎尖和腋芽作为外植体的扩繁速度快，再生植株变异率高 14，但是选取花蕾作为外植体，常受季节限制，茎尖或腋芽取材虽无季节的限制却不易得到变异率较高的植株；而选用叶片作外植体，既具有取材方便易于操作等优点，同时，通过诱导愈伤组织再分化又可望
10、得到变异率较高的再生植株 2。但是纵观前人的研究成果多是以单因素水平来设计的，无法准确理解多因素的相互作用。因此本研究设计了多因素正交试验，研究不同因素对怀菊的叶片诱导为愈伤组织及分化成芽的影响，从中筛选出适宜的培养基，为怀菊的快速繁殖提供理论和技术的帮助。近年来，以怀菊叶片为外植体脱分化诱导愈伤组织再分化形成植株的技术为叶盘法基因工程改造怀菊的品质提供了技术平台，并为进一步筛选出药用成分高和抗逆性强的品种提供了可操作系统 12。1.材料与方法1.1 实验材料怀菊花脱毒苗，由资源植物生物学安徽省重点实验室提供，经薛建平教授鉴定为菊科植物药用怀菊花的脱毒苗。1.2 实验方法 1.2.1 脱毒苗的
11、快繁取五瓶无菌组织培养苗进行快繁，接到 MS + 6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L 培养基上，最终获得十五瓶脱毒苗，放在培养室里，待用。1.2.2 愈伤组织的诱导在无菌超净台上，把脱毒苗的叶片剪下然后剪成块状，尽量使每块叶片上都保留切口，然后分别接种到正交试验表（见表 1）设计的培养基上诱导愈伤组织，每种培养基接 6 瓶（每组中正接和背接各接三瓶，即正面接触培养基的和背面接触培养基的各三瓶）每瓶接种 5 块叶片。十天后观察愈伤组织生长的状况，二十天后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=分化出愈伤组织的叶片总数接种叶片的总数100%1.2.3 芽的分化在无菌超净台上，将上述实验后
12、得到的愈伤组织按照原来的编号接到新配制的培养基（见表1）中，每瓶接种5块愈伤组织，一星期后观察芽的分化情况，并计算发芽率。芽的分化率=分化出芽的数目接种的愈伤组织的块数100%1.2.4 生根培养与移栽当培养的幼苗长至 2.5 至 3.5cm，具 2 至 3 片叶时将其切成单株，接到生根培养基 1/2MS+NAA0.5mg/L 上继续培养，大概一星期后，有小根出现，二十天后形成发达根系。此时，再把培养瓶拿出培养室，放在室外于常温问下炼苗三天，最后移栽到土壤中，将试管苗培养成植株。1.2.5 参数及分析在测算愈伤组织诱导的影响因素时，采用 L9 ( 34 )正交表，根据设计安排组织了 9 次实验
13、。因子水平安排见表 1 中培养基按正交法设计。每组接种六瓶，背接和正接各 3 瓶，每瓶接种 5 块叶片。观察苗的叶片分化为愈伤组织的情况，统计愈伤组织诱导率。待转入新的培养基后，培养一段时间后统计在统计发芽率。 运用正交设计助手v3.1(专业版)软件进行培养基配方设计。 统计分析方法为极差分析和方差分析。1.3 培养基和培养条件怀菊的快繁培养基：MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。诱导愈伤组织的培养基：在基本培养基 MS+Su3%+Ag7.5%上按照表 1 中三种植物激素的组合及浓度配比添加，配成 9 组不同的培养基（见表 3）每种培养基接六瓶，每瓶接 5 块叶
14、片，在黑暗条件下诱导。诱导分化出芽的培养基：同上表 1 中的培养基，每种培养基接三瓶，每瓶接 5 块愈伤组织，培养室的温度为(251)，每天光照 12 h ，光照强度为 1 5002 000 lx。培养基配制好以后都要在高压灭菌锅中灭菌 15min。 表1 L9 ( 34 )正交设计表Table 1 Orthogonal array L 9 ( 34 ) A B C D因素 Factor 2,4-D mg/L 6-BA mg/L NAA mg/L IAA mg/L水平 1 Level 1水平 2 Level 2水平 3 Level 32.01.002.00.50.10.50.200.50.20
15、2.结果分析2.1 怀菊愈伤组织的分化在研究中将培养好的幼苗叶片接种于表 1 所列的 9 种培养基上，于黑暗条件下培养 10 d 左右，发现接种的叶片上有块状的愈伤组织形成,特别是在叶片的切口处愈伤组织形成明显。15d 统计了愈伤组织的诱导率。从表 2 中可以得出背面接触培养基的叶片脱分化形成愈伤组织早于正面接触培养基的叶片。且诱导的成功率远远高于正接方式，所以背面接触培养基的接种方式是最适合的方式。从表 3 的极差分析中可以看出，2，4-D 是影响怀菊叶片愈伤组织分化的主要因素，影响最大，NAA 次之， 6-BA 比较小，IAA 的影响最小。正交表中均值越大，则说明代表该因子的某水平越好，从
16、分化率的角度看，极差分析的结果可以得出诱导怀菊愈伤组织分化的较适宜培养基组合为 MS+2，4-D 2.0mg/L + 6-BA0.1 mg/L+ NAA0.2 mg/L。正交设计是一种均一性设计，不可能含有所有处理组合，所以 A1B3C2D3 在实验中没有显示出来。用此种配比的培养基进行了验证实验，结果表明，怀菊愈伤组织诱导快，诱导率高，从而证明实验结果是正确的。表 2 怀菊愈伤组织诱导率及芽分化率Table 2Differentiating rate of callus and bud of bosom chrysanthemum因素 FactorA B C D处理Treatment 2,4
17、-D mg/L6-BA mg/LNAA mg/LIAA mg/L愈伤诱导率(正接)（%）愈伤诱导率(背接)（%）芽分化率（背接）（%）1 2.0 2.0 0.5 0.5 0 93.3 60.02 2.0 0.5 0.2 0.2 0 100 26.73 2.0 0.1 0 0 6.7 53.3 13.34 1.0 2.0 0.2 0 20 73.3 106.75 1.0 0.5 0 0.5 0 26.7 100.06 1.0 0.1 0.5 0.2 0 6.7 46.77 0 2.0 0 0.2 0 0 133.38 0 0.5 0.5 0 0 20 166.79 0 0.1 0.2 0.5 1
18、3.3 46.7 86.7表3 菊愈伤诱导率的极差分析Table 3Mean deviation of callus of bosom chrysanthemum A B C D因素 Factor2，4-D mg/L 6-BA mg/L NAA mg/L IAA mg/L均值 1 Mean1 82.200 55.533 40.000 48.867均值 2 Mean2 35.567 48.900 73.333 45.567均值 3 Mean3 22.233 35.567 26.667 55.567极差 Range 59.967 19.966 46.666 10.000表4 怀菊愈伤组织诱导率的方
19、差分析Table 4Variance analysis of induction rate of culls of bosom chrysanthemum因素Factor偏差平方和Sum of squares自由度Degree offreedomF 比F valueF 临界（0.05）F critical value显著性SignificanceA 5594.669 2 20.875 19.000 *B 266.669 2 0.995 19.000C 3822.222 2 14.262 19.000误差Error268.00 2注:*表示在 0. 05 水平上差异显著Note:*means s
20、ignificant difference at P=0.05为了进一步反映各因子之间的差异，以便寻求最佳水平，我们进行了方差分析。由极差分析可知，因子方差分析表明(见表 4)因子 A (2,4-D)对愈伤组织的诱导作用显著,因为因子 D(IAA)的影响最不显著，可以设为空白对照。由此可见，2，4-D 是影响怀菊愈伤组织诱导率大小的主要因素，而且此结果与极差分析的结果基本相吻合2.2 芽的分化本试验将上述实验所获得的愈伤组织仍接种到新配制的表 1 所列的 9 种培养基上，于光照强度 15002000 lx 的条件下培养 10 d 左右，发现接种的愈伤组织上有不定芽分化出来， 。20d 左右发现
21、 8 号培养基中不定芽分化明显，幼苗长势很好。4、5、7 号培养基中均有不定芽的分化，但是不定芽的分化较少，茎段细长，叶浅绿。2、3 号培养基中怀菊芽分化的最少而且长势比较差，叶发黄 。将 4、5、7 号培养基中的苗转接到 8 号培养基中，苗的长势恢复正常，茎段变化明显变长，叶墨绿，苗长势很好（见图版 H）从表 5 可以看出：因子 A 的极差最大，因子 D 的极差最小。说明 A 因子（2，4-D ）的影响最大，根据各因子均值的大小可以 得出诱导怀菊愈伤组织分化出芽的培养基以 A3B1C1D3 为最优组合，即 MS + 6-BA2.0 mg/L + NAA0.5mg/L。说明诱导芽的分化时不需要
22、 2，4-D 参与，当加入 2，4-D 时对芽分化的影响较明显，研究结果也显示高浓度的 2，4-D 也会抑制芽的形成。虽然IAA 对诱导芽的分化作用不明显，实验中并不能显示出高浓度的 IAA 是否对芽的分化产生影响，还需要进一步的实验验证。如上所述，正交设计是一种均一性设计，所以 A3B1C1D3 在实验中没有显示出来。用此种配比的培养基进行了验证实验，结果表明，怀菊的不定芽分化快，苗质好，分化率高，从而证明实验结果是正确的。表5 芽分化的极差分析Table 5 Mean deviation of bud of bosom chrysanthemumA B C D因素 Factor2，4-D
23、mg/L 6-BA mg/L NAA mg/L IAA mg/L均值 1 Mean1 33.333 100.000 91.133 89.233均值 2 Mean2 84.467 97.800 73.367 88.900均值 3 Mean3 128.900 48.900 82.200 95.567极差 Range 95.567 51.100 17.766 6.667表6 怀菊芽分化的方差分析Table 6Variance analysis of induction rate of bud of bosom chrysanthemum 因素Factor偏差平方和Sum of squares自由度D
24、egree offreedomF 比F valueF 临界（0.05）F critical value显著性SignificanceA 13721.927 2 28.981 19.000 *B 5007.260 2 10.575 19.000C 473.487 2 1.000 19.000误差Error473.49 2注:*表示在 0. 05 水平上差异显著Note:*means significant difference at P=0.05从表 6 的方差分析表中可以看出 A（2，4-D）的作用显著，说明 2，4-D 对诱导芽分化的影响很大，2，4-D 的加入对芽的分化会起到反作用，抑制芽
25、的分化。同样，因为因子 D（IAA）的影响最不显著，可作为空白对照。 2.3 生根培养与移栽待分化培养基上的苗长到45 cm 时，将健壮的丛生苗在无菌条件下分成单株后，转接到生根培养基1/2MS+NAA 0.5mg/L+ 蔗糖 30g/L，25 d 后开始生根 4。待根长至45 cm时先在室内炼苗，即将封口膜打开放置3d后再拿出培养室，仍将苗放在培养瓶中，置于常温下炼苗23 d，接着再向瓶中加入少量温水，软化培养基后取出试管苗，洗去基部培养基，移栽至土壤中培养。3.讨论3.1 菊叶片类型及接种方式对怀菊组织培养的影响在试验中还发现叶龄对叶片组织培养也是一个重要的因素，叶龄过老，再生困难；叶龄过
26、小的嫩叶往往培养后易坏死。因此应选择植株上部的 2-3 片幼龄健壮叶作培养材料 9，而且不管是正接还是背接的叶片在靠近叶柄的近端再生能力明显高于叶顶部。所以在怀菊叶片组织培养的快速繁殖和愈伤组织诱导过程中，应选择合适的叶片，才能提高实验的正确率。本研究采用怀菊叶片作为实验材料，15d 以后在接入的叶片切口处有愈伤被诱导出来，但是在没有切口或只有很小的切口的叶片的周围就很难发现愈伤组织的生成，有时直到叶子干枯而死也没有愈伤的生成，说明做实验时，应将剪下的叶片切成小块，留有更多的切口，这样能够快速的诱导出愈伤组织 13。 在怀菊叶片组织培养中，当叶片背接时愈伤的诱导率远远高于正接的方式，这可能与叶
27、片的极性有关。当叶片背接时，叶片向下反卷生长，叶柄和尖端插入培养基中，叶片也可以从培养基中吸收水分；而且背面气孔多，也有助于水分和养分的吸收。但是当叶片正接时，叶片向上反卷生长，叶柄和叶尖不能接触培养基，使得叶片无法从培养基中吸收养分，从而造成生长停滞，出现坏死现象愈伤的诱导率和芽的分化率较低 10。所以在做怀菊叶片组织培养时应选择背面接触培养基的方式，才能提高效率。3.2 植物生长物质对诱导愈伤组织的影响植物的组织培养、细胞分化是一个复杂的生理生化过程 7。大量实验表明，在组织培养中，植物激素和植物生长调节物质的种类、浓度以及它们之间的组合直接影响着愈伤组织的诱导 5，而且对试验结果有相当大的影响。
