原代细胞培养步骤

1、MDCK 细胞培养MEM 细胞生长液配制500ml MEM 液+5ml 双抗（青霉素+链霉素）+5ml L-谷氨酰胺+7.5ml 碳酸氢钠+50ml 小牛血清90%MEM 液 1%双抗 1% L-谷氨酰胺 1.5%碳酸氢钠 10%小牛血清0.25%EDTA 胰酶（从冰箱取出后放入培养箱中待用） （1）细胞传代将细胞瓶中的生长液倒去，加入 MEM 液（大概 6ml 左右）清洗，倒去;加入 EDTA-胰酶（根据细胞消化情况而加量） ，倒去;再加入 EDTA-胰酶，放置培养箱，进行消化（大概 10 分钟左右） ，待其细胞开始脱落后（在细胞瓶中呈毛玻璃）;吸干 EDTA-胰酶倒去，放置培养箱一段时间（细胞呈逐个完整） ，。

2、神经元细胞培养灭菌准备：1、将玻璃培养皿（3 个） 、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌2、将显微镜搬至超净台灭菌3、将直头镊（1 个） 、弯头镊（1 个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台材料准备：17 天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL 离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3 个） 、10cm 培养皿（1 个） 、计数器、包被好的培养板1、处死孕鼠，取小鼠，放入 50mL 离心管（冰块上） ，移至超净台，2、将小鼠倒入盛有 PBS 的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜3、将头取出（左手直。

3、细胞培养的操作步骤一 、原 代培 养及 其操 作步 骤 原 代 分 离 细 胞 培 养 是 指 从 供 体 内 取 出 组 织 后 ， 经 机 械 以 及 消 化 分 离 成 单 个 细 胞 或 单 一型 细胞 群， 使之 在体 外模 拟人 体生 理环 境， 在无 菌、 适当 温度 和一 定的 营养 条件 下， 生存 、生 长和 繁殖 。 原 代培 养细 胞常 有不 同的 细胞 成分 ， 生 长缓 慢 ， 但 是更 能代 表所 来源 的组 织细胞 类型 和表 达组 织的 特异 性特 征 。 利 用原 代细 胞培 养做 各种 实验 ， 如 药物 测试 、 细 胞分 化及病 毒学 方面 的试 验效 果很 好。 其。

4、实验二 传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒 方法。二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于 Vero 细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞 三、材料1、100ml 细胞瓶、吸管、吸球、96 孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含 10%犊牛血清。

5、雌雄鼠交配后第二天 7:00 观察阴栓，看到阴栓当日记为孕 0d。孕 12d 脱颈处死，消毒后剖腹，取出子宫后将子宫在 D-Hanks 液中涮洗至无血色（约 3 遍）后，分离出胚胎，要轻轻剥离，注意镊子不要夹到胚胎，倒 D-Hanks 液在超净台中完成，倒前瓶子要在酒精灯上烧一下，盖瓶盖前也要将瓶盖和瓶口在酒精灯上烧一下。将胚胎在 D-Hanks 液中涮洗至没有血液（约 3 遍），将胚胎转移至 37的 D-Hanks 液中，于解剖显微镜下分离前后肢芽或中脑等需要的组织，并将所需组织用吸管吸到另一个平皿中。全过程不是在超净台内，但要注意无菌操作，所用镊子。

6、细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。1.剪切组织 先将所取得的组织，用 D-Hanks 或 Hanks 液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织。

7、实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以 1：2 或其他比例转移到另一。

8、初代培养原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至 37），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37） 材料：动物组织块 试剂：1640 培养基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks 液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒 20 分钟。开始工。

9、培养基的配置：基础培养基 500ml+胎牛血清 50ml+双抗 5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清 2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器 1 套（2.5l、20l、200l、1ml） ，酒精灯 1 盏，液器 1 台，斜架 1 台，酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，常规耗材：培养瓶（50 2） ，定量移液管（5ml、10ml） ，枪头（1ml、200l 、10l ） ，培养皿， 6/24/48/96 孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco 高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精。

10、1原代心肌细胞培养方法探讨 1邵伟 （山东省千佛山医院 山东济南 250014）周苏宁 邵建华 （山东大学医学院 山东省立医院 山东济南 250021）摘要 探讨培养 Wister 新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE 染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达 94.6；肌动蛋白（HHF35）经 S-P 法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达 96.4。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、。

11、原代细胞培养实验,费晓芳,掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解倒置显微镜的使用。,实验目的和要求：,实验原理：,原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。,实验内容：,动物的选择：选择大约一半足孕时间的胚胎，1013天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生。

12、细胞培养前需要准备的物品提前开启 37水浴锅和超净台的紫外灯；灭菌吸头、1.5mL 的离心管、空玻璃瓶；无菌的 15mL、50mL 离心管；无菌的 10cm 培养皿、16 孔板、32 孔板、96 孔板、培养瓶等。5mL、10mL 的移液管；橡胶手套、普通移液器、电子移液器、装有 99.9%-100%CO2钢瓶70%酒精、 DMEM 培养基（37提前温浴） 、FBS 血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin 和 10,000ug/mL Streptomycin 混合液） 、0.05% typsin-EDTA（上述培养细胞所用试剂都用 GIBCO 的产品，国产的产品没有办法保证质量）细胞培养步骤1. 取一瓶液体 DMEM 培养液。

13、目录,细胞培养基本概念 细胞培养基本要求 细胞培养基本技术,细胞培养定义,定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 优点： 1活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）； 缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全。

14、乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养 一、 实验动物 13日龄C57小鼠乳鼠10只。二、 试剂及配制高糖DMEM( gibco)、型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及01% 型胶原酶以21混合, 现配现用。三、 实验仪器超净工作台、CO 2培养箱、光学倒置显微镜、离。

15、 1 材料 1 1 动物 出生后 1 4 天 SD 乳鼠 15 只 1 2 试剂 低糖 DMEM 胰酶 含 EDTA 青链霉素 碳酸氢钠液 新生牛血清 谷氨酰胺 D Hanks 液 0 1 新洁尔灭 碘酒 75 酒精 培养液 培养液 DMEM 新生牛血清 青链霉素 1 3 手术器械和仪器 铝盒 眼科直剪 眼科弯剪 眼科直镊 眼科弯剪 玻璃培养皿 共 2 套 一套用于解剖取材 另一套用于剪碎心脏组织。

16、1神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧） 、化学和生物因子（如神经营养。

17、鸡胚原代细胞培养实验材料910 日龄鸡胚，Hank“s 液 50mL，05水解乳蛋白液或 MEM 培养液20mL(内含犊牛血清 1mL，双抗 02mL，pH7 2)，O25胰蛋白酶5mL、7 NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL 三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用) ，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95酒精，水浴锅。实验内容及操作程序1配液制备细胞前先在 Hnak“s 液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素 100g/mL，用 7NaHC03 调整 pH 至 7274 ，将胰蛋白酶调整 pH76(玫瑰红色 )。置 37水浴锅中预热备用。2. 取胚及剪碎将胚蛋。

18、原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求.1取材要注意新鲜和保鲜.2应严格无菌.3防止机械损伤.4去除无用组织和避免干燥.5应注意组织类型、分化程度、年龄等.6作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织。

19、Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells 齐氏生物科技有限公司 2015年第三次经销商培训会 技术部 张亚洲 原代细胞培养相关产品 市场拓展培训 Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells 目录 原代 细胞 培养 基本概念 原代 细胞 培养 基本要求 原代 细胞 培养 基本技术 Your Reliable Source of Human and Animal Primary Cells 原代细胞培养 指的是将细胞从动物体中直接取出，模拟体内。

20、原代培养(primary culture)，准备工作：A 玻璃用品清洁，灭局步骤：1， 洗涤剂正常洗刷干净2， 放入托盘中，200 度烤 1-2h（烘干）3， 泡酸（过夜） ，吸管捆好，做好记录4， 捞酸，冲洗干净（注意安全）5， 放入托盘中，200 度烤 1-2h（烘干）6， 包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好7， 放入托盘中，200 度烤 2h（灭菌）8， 收集放好B 塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤1， 用洗涤剂正常刷洗干净2， 晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）3， 次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏。