1、鸡胚原代细胞培养实验材料910 日龄鸡胚，Hank“s 液 50mL，05水解乳蛋白液或 MEM 培养液20mL(内含犊牛血清 1mL，双抗 02mL，pH7 2)，O25胰蛋白酶5mL、7 NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL 三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用) ，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95酒精，水浴锅。实验内容及操作程序1配液制备细胞前先在 Hnak“s 液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素 100g/mL，用 7NaHC03 调整 pH 至 7274 ，将胰蛋白酶调整 pH76(玫瑰红色 )。置 37水浴锅中预热备
2、用。2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用 Hank“s 液(简称 H 液) 洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约 1mm3 大小的碎块，加 5mL H 液轻摇，静止 12min ，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗 2 次，至上悬液不混浊为止，吸干 H 液留组织。3消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约 35 倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需 5mL 胰酶，三角瓶上加塞，以免 CO2 挥发及污染。37水浴约20min 左右，每隔 5min
3、 轻轻摇动 1 次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。4洗涤取出三角瓶后静置 1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用 10mL Hank“s 液反复轻洗 3 次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。5吹打加 2mL 含血清的 05水解乳蛋白营养液或：MEM 培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出 1mL 于 20mL 营养液中，此液细胞
4、数约 50 万70 万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做 100mL 细胞悬液。6细胞计数取上述细胞悬液 05mL 加入 01结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液 2mL，置室温或 37温箱中 510min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如 35 个聚集在一起，则按 1 个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/mL=4 大格细胞总数 /410 000稀释倍数例如：4 大格的细胞总数为 284 个，而稀释倍数为 5(05mL 染色液)，则每毫升细胞悬液的细胞数为 2
5、84/410 0005=35104 个。7稀释按照每毫升 50 万70 万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。(计数时，可见到大部分细胞完整分散，35 个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。)活细胞计数法取 2台盼蓝溶液 1 滴，细胞悬液 1 滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。8分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约 1mL，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或 C02 跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置 37温箱培养，4h
6、后细胞即可贴附于瓶壁，2436h 生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1Hanks 液配制原液甲NaCl 8gKCl 2gMgSO47H20 2gMgCl26H20 2g28 CaCl2 100mL双蒸水 加至 1 000mL先将固体成分加于 800mL 双蒸水中，加温到 5060 加速溶解，再加入CaCl2 溶液，最后加双蒸水补足到 1 000mL。加氯仿 2mL，摇匀后于 4贮存。原液乙Na2HPO42H20 1.2gKH2PO42H20 1.2g葡萄糖 20g04 酚红 lOOmL双蒸水 加：1 000mL将上列各物混合后使其溶解，
7、加氯仿 2mL，摇匀后于 4贮存。Hank“s 工作液原液甲 1 份原液乙 1 份双蒸水 18 份工作液分装 100mL，或 500mL 盐水瓶中，115C 灭菌 10min，使用前以7NaHCO3 调节pH 至 0 727 6。20 4酚红溶液配制酚红 0.4g01 NaOH 溶液 11.28mL将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加 NaOH 溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至lOOmL 量杯中，最后加双蒸水至 lOOmL，摇匀后，保存于 4冰箱内备用。3. 0.5乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物 5gHank“s 液 l 000mL将乳蛋白水解物放入 1 000mL Hank“s 液中，待完全溶
8、解后，摇匀分装于lOOmL 的盐水瓶中，每瓶 95mL，115 lOmin 灭菌，4贮存备用。4营养液(生长液)配制O5乳蛋白水解物 95mL犊牛血清 5mL青霉素、链霉素 lmL将上述溶液混合后，以 7NaHCO3 适量调节 pH 到 7.27.4 。维持液按上述方法，加犊牛血清 2.5mL 即成。5MEM 培养液 MEM 培养基一袋，加 1 000mL 双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于 100ml 盐水瓶中，每瓶 90ml，用前以 7NaHC03 调 pH 到7.27.4，并加 10犊牛血清。6双抗配制青霉素 100 万 IU链霉素 1gHank“s 液 100mL将青、链霉素溶解于：1
9、00mL Hank“s 溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lmL，内含有青霉素 IIU，链霉素 10000g，低温冻结保存。使用时每 100mL 营养液中加双抗 lmL，即每 mL 营养液中含青霉素 100IU，链霉素100gg。7. 7 NaHCO3 溶液配制NaHCO3 7g双蒸水 100mL将 NaHC03 溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115 10min 灭菌后，无菌操作分装小瓶，每瓶 lmL，4保存。8. 0.25胰蛋白酶 配制胰蛋白 0.25gHangs 液 100mL将胰蛋白酶溶于 Hank“s 液中，待完全溶解后，用 0.2m滤膜过滤，检验无菌后才能使用。无菌分装小瓶，每瓶 5mL，低温冻结保存。使用时，以7NaHC03 调节 pH 到 7.6-7.8
