1、原代培养(primary culture)，准备工作：A 玻璃用品清洁，灭局步骤：1， 洗涤剂正常洗刷干净2， 放入托盘中，200 度烤 1-2h（烘干）3， 泡酸（过夜） ，吸管捆好，做好记录4， 捞酸，冲洗干净（注意安全）5， 放入托盘中，200 度烤 1-2h（烘干）6， 包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好7， 放入托盘中，200 度烤 2h（灭菌）8， 收集放好B 塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤1， 用洗涤剂正常刷洗干净2， 晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）3， 次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏水，三蒸水，去离子水）4， 放入
2、饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干C 器械盒（3 把剪刀，2 把镊子， 2 个烧杯，2 个滤网，2 个培养皿）1， 洗涤剂冲洗干净2， 过三水3， 放入饭盒中压，烘干乳鼠心肌原代培养过程：A 准备工作：1，剪封口膜（3-4 个长的；鼠的只数 x2+2 的短封口膜）2，器械：平镊，弯镊，剪刀（3 把） ，筛网3，离心管，吸管，平皿 1 对，50ml 烧杯 1 个，冰袋4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶（不含 EDTA除 去 细 胞 互 相 粘 着 所 依 赖 的 Ca2+， 再经 机 械 轻 度 振 荡 ， 使 之 成 为 单 细 胞 。 ）B 步骤（一）准备1，将所需的离心管放在试管架上(P
3、S：大概一只心脏一只离心管；多准备 3 个-2 个消化细胞用，一个放混匀用的吸管用)2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆（PS：2 个吸管-胰酶和混匀用；一个移液管-移取培养液用）3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里4，打开器械，按顺序依次摆放（2 把剪刀；一把弯镊）5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入DMEM(无血清)（二）取乳鼠心脏1，戴无菌手套，将小鼠浸入酒精中消毒，捏抓小鼠背部皮肤，用 1st 剪刀剪掉头部，然后剪开皮肤，在用 2nd 剪刀，剪开胸骨（靠左侧点）用镊子夹取心脏，放入 DMEM 平
4、皿中，注意镊子不要碰到别处。 （PS：剪时不要剪到腹腔，避免污染）2，待所有乳鼠心脏取完后（将心脏上带的血管和心房剪掉）3，将剩下的心室剪成均匀的几块（*均匀）（三）消化1，用吸管，将均匀几等分的心脏，吸入离心管中，将上清 DMEM 弃掉，加入大约组织块2 倍的胰酶，进行消化，封口，放入 37 度水浴锅中摇晃，大约 3 分钟，用吸管将胰酶吸出弃掉。 （清洗组织）2，重新加入新的胰酶，封口，放入 37 度水浴锅中摇晃，大约 1 分钟，timer 计时（具体时间可以依胰酶活性再摸索） ，待液体浑浊时（液体不要变黄-消化过了；白色范围内即可） ，将液体吸出，放入另一个离心管中加入等体积的 DMEM+
5、FBS 以中和胰酶，注意混匀，封口，放入 4 度，而原有组织块的离心管，再加入 2 倍的胰酶。3，重复，操作“2”6-7 次，直至组织块消化完。4，消化液在不锈钢筛网上过滤，之后再将烧杯中的液体加入新的离心管中，封好，2500r/3min（1500r/5min）离心。 （PS：离心后，不要震动将沉淀震开）5， 离心后，迅速倒掉上清，向离心管中加入培养液（90%DMEM+10%FBS）6， 轻摇吹匀，吸入培养瓶中，瓶口旋松，倒置，放入 CO2 培养孵箱中（PS ：3 只鼠一只培养瓶；每个培养瓶 4ml 培养液；一只鼠一个小皿；每个小皿 1-2ml 培养液）7， 差速贴壁：（1） 在 1.5-2h
6、 后，将倒置的瓶正着取出，用 10-100uL 枪以 100:1 的比例加入双抗和BRDU（抗成纤维生长） ，放入 CO2 孵箱中培养（正方）（2） 48 小时心肌细胞贴壁，换液（有血清 DMEM，注用 PBS 清洗细胞表面，不要将贴壁细胞吹起）注：原代细胞培养后，48 小时换液第二天早上，培养，换液后的细胞状态良好才可以用转染，转染试剂+mi-RNA，混合 15-20min转染试剂用量：瓶+10ul；6 孔+5ul转染 6h 后换液；转染换液后 24h 后可以用。转染注意事项：1，有 n 个孔，摆 2n 个 EP 管，分别加入 1/2 量 opti+转染试剂和 1/2 opti+mi-RNA
7、2，X-treme 在 5min 内要将 2 者混起来，lipo 是 5min 以上；混合 20min 左右，则可加入细胞中。3， 加入时，将培养液弄起，缓慢加入培养液内，不要碰到细胞转染时的比例：瓶：4000ul 培养液（无血清） +1000ul opti(10ul X-treme+490ul opti；10ul mi-RNA+490ul opti)6 孔板：1600ul 培养液（无血清） +200ul opti(5ul X-treme+95ul opti；5ul mi-RNA+95ul opti)24 孔板：900ul 培养液（无血清） +100ul opti(1ul X-treme+49ul opti；1ul mi-RNA+49ul opti)PS：转染是将外源基因导入细胞内的一种专门技术。
