1、第二章 气相色谱法,南京工业大学生物与制药工程学院 国家生化工程技术研究中心,余定华 博士，副教授,上节课内容回顾,气相色谱的定性分析气相色谱的定量分析气相色谱柱,12.6 色谱定性分析方法,纯标准样对照,文献值对照,仪器联用定性,色谱自身定性保留值,12.7 色谱定量分析方法,定量依据：组分含量与峰面积成正比,峰面积A测定,积分软件,强大的分离能力,12.7 色谱定量分析方法,定量校正因子,原因:不同检测器对不同组分的灵敏度不同,测量f 常用标准物:苯(TCD), 正庚烷（FID),12.7 色谱定量分析方法,为什么要引入校正因子？,TCD原理： 热导系数差，样品与载气,液体的比重概念，水与
2、乙醇,定量的分析方法 (1) -面积百分比方法(面积归一法)-,不需要标准样品。 样品中的所有组份必需被检出。 所有成份的相对灵敏度必需一样。 测量时需知道大致的浓度。（不能作精确的定量）,未知样品,成份 A,峰面积,1000,2000,500,1000,面积之和 : 4500,+,+,=,+,成份 A 的浓度是,定量分析方法 (2) 校正面积百分比法(校正面积归一法),标准样品中所有的成份的浓度必需已知。 样品的所有的成份必需被检出。 每个成份的浓度都要被相对灵敏度修正。 主要用于高压钢瓶中气体或石油样品等的分析,标准样品 (各成份等量混合),峰面积,1000,1500,1000,500,+
3、,+,+,成份 A 的浓度是,未知样品,成份 A,峰面积,1000,2000,500,1000,相对灵敏度修正以后的面积总和: 2417,+,+,=,+,相对灵敏度,2,3,2,1,:,:,:,相对灵敏度,2,3,2,1,定量分析方法 (3) -绝对校准曲线方法(外标法) -,已知浓度的标准样品是必需的。 如果至少目标成份被检出,定量可能的。 分析比较简单 进样量的错误会直接引起结果的错误,标准样品 1 ul (成份 A 100 ppm),成份 A,未知样品 1 uL,成份 A,峰面积 ： 700,峰面积： 1000,100,浓度 (ppm),1000,峰面积,700,70,成份 A 的浓度是
4、 70ppm,定量分析方法 (4) -内标法-,已知浓度的标准样品 (目标成份 +内标) 是必需的。 如果要定量至少目标成份和内标必需被检出 进样量的错误也能被改正。 是定量最准确的分析方法。 在未知样品中内标物的量应该添加准确。,未知样品+内标:100ppm 1 uL,成份 A,1,浓度比,1.2,峰面积比,0.7,0.58,标准样品 1 L 成份 A:100ppm 内标:100ppm,成份 A,峰面积,1200,1000,峰面积比,1.2,内标：IS,内标：IS,峰面积,700,1000,峰面积比,0.7,在未知的样品中 成份 A 的浓度 内标浓度:100ppm 浓度比:0.58 = 58
5、ppm,Internal Standard | 内标,内标物所必需的特性 内标峰必需和样品中的其它所有物质的峰能够完全分开。 内标物应该在目标峰附近出峰。 内标物应该与目标成份的化学性质相似。 (同系物等是比较理想的) 内标物化学性质应该的稳定的。,在内标法中, “选择内标物质的相当重要的- 而且的困难的,第七节 气相色谱检测器,气相色谱检测器是把载气里被分离的各组分的浓度或质量 转换成电信号的装置。目前检测器的种类多达数十种。根据 检测原理的不同，可将其分为浓度型检测器和质量型检测器 两种： （l）浓度型检测器 测量的是载气中某组分浓度瞬间的变 化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比。如热导
6、检测器 和电子捕获检测器。 （2）质量型检测器 测量的是载气中某组分进入检测器的速 度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分 的量成正比。如火焰离子化检测器和火焰光度检测器等。,一、热导检测器（TCD） 热导检测器是根据不同的物质具有不同的热导系数原理制成的。热导检测器由于结构简单，性能稳定，几乎对所有物质都有响应，通用性好，而且线性范围宽，价格便宜，因此是应用最广，最成熟的一种检测器。其主要缺点是灵敏度较低。,1热导池的结构和工作原理 热导池由池体和热敏元件构成，可分双臂和四臂热导池 两种。由于四臂热导池热丝的阻值比双臂热导池增加一倍， 故灵敏度也提高一倍。目前仪器中都采用四根金
7、属丝组成的 四臂热导地。其中二臂为参比臂，另二臂为测量臂，将参比 臂和测量臂接入惠斯电桥，由恒定的电流加热组成热导地测 量线路，如前图所示。,2影响热导检测器灵敏度的因素 （l）桥电流 桥电流增加，使钨丝温度提高，钨丝和热导池体的温差加大，气体就容易将热量传出去，灵敏度就提高。响应值与工作电流的三次方成正比。所以，增大电流有利于提高灵敏度，但电流太大会影响钨丝寿命。一般桥电流控制在1OO20OmA左右（N2作载气时为100150mAH2作载气时150200mA为宜）。 （2）池体温度 池体温度降低，可使池体和钨丝温差加大，有利于提高灵敏度。但池体温度过低，被测试样会冷凝在检测器中。池体温度一般
8、不应低于柱温。,(3)载气种类 载气与试样的热导系数相差愈大，则灵敏度愈 高。故选择热导系数大的氢气或氦气作载气有利于灵敏度提 高。如用氮气作载气时，有些试样（如甲烷）的热导系数比 它大就会出现倒峰。表列出某些气体与蒸气的热导系数。 (4)热敏元件的阻值 阻值高、温度系数较大的热敏元件，灵 敏度高。钨丝是一种广泛应用的热敏元件，它的阻值随温度 升高而增大，其电阻温度系数为5.510-3cm-1-1，电阻 率为5.51O-6cm。为防止钨丝气化，可在表面镀金或镍。,二. 氢火焰离子化检测器（FID）,火焰离子化检测器是以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电
9、场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。,它的特点是：灵敏度很高，比热导检测器的灵敏度高约103倍；检出限低，可达10-12gS-1；火焰离子化检测器能检测大多数含碳有机化合物；死体积小，响应速度快，线性范围也宽，可达106以上；而且结构不复杂，操作简单，是目前应用最广泛的色谱检测器之一。其主要缺点是不能检测永久性气体、水、一氧化碳、二氧化碳、氮的氧化物、硫化氢等物质。 1. 结构,2火焰离子化机理 至今还不十分清楚其机理，普遍认为这是一个化学电离过程。有机物在火焰中先形成自由基，然后与氧产生正离子，再同水反应生成H3O+离子。以苯为例，在氢火焰中的化
10、学电离反应如下：,3.影响操作条件的因素离子室的结构对火焰离子化检测器的灵敏度有直接影 响，操作条件的变化，包括氢气、载气、空气流速和检测 室的温度等都对检测器灵敏度有影响,三.电子捕获检测器(ECD),电子捕获检测器也称电子俘获检测器，它是一种选择性很 强的检测器，对具有电负性物质（如含卤素、硫、磷、氰等 的物质）的检测有很高灵敏度(检出限约10-14gcm-3)。它是目 前分析痕量电负性有机物最有效的检测器。电子捕获检测器 已广泛应用于农药残留量、大气及水质污染分析，以及生物 化学、医学、药物学和环境监测等领域中。它的缺点是线性 范围窄，只有103左右，且响应易受操作条件的影响，重现性 较
11、差。,1电于捕获检测器的结构与工作原理实际上它是一种放射性离子化检测器，与火焰离子化检测器相似，也需要一个能源和一个电场。能源多数用63Ni或3H放射源，其结构如下图。,检测器内腔有两个电极和筒状的放射源。放射源贴在 阴极壁上，以不锈钢棒作正极，在两极施加直流或脉冲电压。 放射源的射线将载气（N2或Ar）电离，产生次级电子和正 离子，在电场作用下，电子向正极走向移动，形成恒定基流 当载气带有电负性溶质进入检测器时，电负性溶质就能捕获 这些低能量的自由电子，形成稳定的负离子，负离子再与载 气正离子复合成中性化合物，使基流降低而产生负信号 倒峰 。,2捕获机理 捕获机理可用以下反应式表示：,四.火
12、焰光度检测器(FPD),火焰光度检测器，又称硫、磷检测器，它是一种对含磷、硫有机化合物具有高选择性和高灵敏度的质量型检测器，检出限可达10-12gS-1（对P）或10-11gS-11（对S）。这种检测器可用于大气中痕量硫化物以及农副产品，水中的毫微克级有机磷和有机硫农药残留量的测定。,1火焰光度检测器的结构,2火焰光度检测器的工作原理根据硫和磷化合物在富氢火焰中燃烧时，生成化学发光物 质，并能发射出特征波长的光，记录这些特征光谱，就能检 测硫和磷以硫为例，有以下反应发生：,当激发态S2*分子返回基态时发射出特征波长光max为394nm。对含磷化合物燃烧时生成磷的氧化物，然后在富氢火焰中被氢还原
13、，形成化学发光的HPO碎片，并发射出max为526nm的特征光谱。这些光由光电信增管转换成信号，经放大后由记录仪记录。,检测器,通用型检测器（ Universal Detector) 热导检测器（TCD） 氢火焰检测器（FID） 选择性检测器 电子捕获（ECD） 脉冲火焰光度检测器 （PFPD） 氮磷检测器（TSD),五、检测器的性能指标,要求：响应快、灵敏度高、稳定性好、线性范围宽。 1、灵敏度（响应值或应答值）,一定浓度或一定质量的试样进入检测器后，就产生一定的相应信号R。如果以进样量Q对检测器作图，就可得到一直线。 图中直线的斜率就是检测器的灵敏度。,浓度型检测器的灵敏度：,Sc浓度型检
14、测器灵敏度 C1记录仪灵敏度(mVcm-1)；C2记录仪纸速的倒数(mincm-1); F0流速；A峰面积； m进样量（mg）浓度型检测器的灵敏度的单位是mVmLmg-1，即每毫升载气中有一毫克气试样时在检测器所能产生的相应信号，单位mV。若试样为气体，灵敏度单位是mVmLmL-1。,质量型检测器灵敏度：,2、检出限D（detection limit）,检出限也称敏感度。是指检测器恰能产生和噪声相鉴别的信号时，在单位体积或时间需向检测器进入的物质质量（单位为g）通常认为恰能鉴别的响应信号重力应等于检测器噪声的3倍。 检出限以D表示，则可定义为,N为检测器噪声，指由于各种因素所引起的基线在段时间
15、内左右偏差值（单位mv），S为检测器的灵敏度。 一般；D值越小说明仪器越敏感。,3、最小检出量Q。（minimum detectable quantity）,指检测器恰能产生和噪声相鉴别的信号时所需进入色谱柱的最小物质量（或最小浓度），以Q。表示。 对于质量型检测器：Q01.065Y1/2D （2-51） 对于浓度型检测器：Q0=1.065Y1/2F0D （2-52） Q0与检测器的检出限成正比，但与检出限不同。 Q0不仅与检测器性能有关，还与柱效率即操作条件有关。所得色谱峰的半宽度越窄，Q0就越小。,目标成份的峰高 (10 pg) S = 16000,噪音的高度N=5200,S/N = 16
16、000 / 5200 = 3.1 在左图中的峰, 10 pg 的样品信噪比（S/ N） 为 3.1 计算当 S/ N= 2时, 样品的量 5200 / 16000 x 10(pg) x 2 = 6.5(pg)该化合物检测限（S/N= 2) 为6.5pg.,最小可检限 （检测极限) 通常,信噪比（S/N） =2-3 最小可定量限 通常,信噪比（S/N） =10-20,最小可检限和最小定量限,目标成份的峰高 (10 pg) S = 16000,噪音高度N=5200,5200 / 16000 x 10(pg) / 4(sec) x 2 = 1.6(pg/sec) 这个化合物的每秒最小可检测量 (假设
17、 S/N=2) 为1.6 pg/sec 而当检测器对特定元素响应时如 FID(C) 、 FTD(N 或者 P) 和 FPD(S 或者 P 或者 Sn) 它以每秒能响应的该元素的量来表达。 举例来说，假设左侧的峰是 磷酸三丁酯 (C4H9)3PO4 (MW:266) ，而且检测器是 FPD, (P 的 AW:31) 1.6 (pg/sec) x 31 / 266 = 0.19 pgP/sec则FPD使用磷酸三丁酯（S/N=2时）来测试磷元素时检测器的最小可检量为0.19 pgP/sec.,因为成份的量（面积）一样时，峰的高度会随着峰宽度变化而变化，检测器的最小检量以样品出峰在 S/N =2时每秒
18、化合物的量来表示。,半峰宽 W1/2 = 4(sec),检测器的最小可检量 （MDQ),要求检测器能够迅速的和真实的反应通过它的物质的浓度变化情况，即要求相应速度快。检测器体积要小，电路系统的滞后现象尽可能小，一般小于1s，记录仪的全行程时间要（1s）。,4、响应时间（response time）,指试样量与信号之间保持线性关系的范围，用最大进样量与最小检出量的比值来表示，这个范围越大，越有利于准确定量。,5、线性范围（linear range）,仪器维护和实验技术,一、日常维护 1、气路的试漏 2、气体净化管 3、气路清洗 管路、空气压缩机出口与气相色谱仪入口、气化室 4、更换进样口密封垫
19、5、检测器清洗,每6-12个月或当指示型捕集阱颜色改变时 更换时间取决于捕集阱的容量与气体纯度,每1-2年校准一次,样品瓶及隔垫应当一次性使用 重复使用通常导致定量误差较大, 活性待测组份易被吸附, 导致峰形拖尾或峰高变小,每3个月 当发现注射器中有明显的清洗不掉的污染物, 或推杆难以抽动, 或当推杆粘连时, 或进样口隔垫穿刺出现异常, 或当针头被堵塞时,每60针样品 裂口, 进样口衬管内有碎屑, 保留时间偏移, 柱压降低等等,每月 与衬管一起更换, 或视磨损情况更换,每周 经常检查, 当衬管内有可见的污染物或色谱性能下降时更换,每月 经常检查, 当有划痕, 腐蚀或非挥发性组分造成堵塞, 污染
20、时更换,每次更换色谱柱, 进样口/检测器部件时更换,GC消耗品更换时间表,二、分析条件选择,1、载气 种类、流速、压力 2、固定液配比 气体或低沸点样品：10:100；一般液体样品：5:100；高沸程样品：3:100以下。 3、担体 种类、大小（80100目） 4、温度 柱温、气化温度、检测器温度 5、色谱柱 柱材、柱长、柱径 6、进样 进样量（对TCD，气体0.1-10ml、液体1-5l；对FID，0.1-1 l。）进样技巧,三、填充色谱柱的制备,1、色谱柱试漏和清洗 2、担体和固定液的计算 担体120-140%柱体积；固定液（根据固定液配比计算） 3、涂渍固定液 4、色谱柱装填 5、色谱柱
21、的老化,食品与香料,分析实例 食品中的天然香精香料 人工香精香料 饮料中的醇类,样品: 比萨,色谱分析领域(1),生命科学,气相色谱分析实例 体液和组织中的药品 血醇水平 药品纯度,色谱分析领域(2),石化,DB-1, 15 m x 0.25 mm I.D. 0.25 m film Stegosaurus-o-gram,分析实例 燃料油定级 汽车排放的废气,色谱分析领域(3),环境,色谱分析领域(4),1、色谱图上的色谱峰流出曲线可说明什么问题？,2、衡量区域宽度方法有哪几种？如何定义？它们之间的关系如何？,3、在色谱流出曲线上，两峰间的距离取决于相应两组分在两相间的分配系数还是扩散速度？为什么？,4、利用保留值定性的依据是什么？,5、分析范第姆特方程，应如何选择色谱条件来增加柱效？,6、请简述色谱法分离的原理。,7、气相色谱仪的组成系统包括哪些？,谢谢大家,气相色谱分析方法到此结束,
