1、第二章 色谱理论基础 及 气相色谱法,第一节色谱法概述,固定相,流动相,色谱柱,一、色谱起源及发展,色谱法的发展历史,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作,二、色谱法定义和特点,1、色谱法的定义 定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法 实质：分离 目的：定性分析或定量分析 色谱法与光谱法的主要区别：色谱法具有分离及分析功能，而光谱法不具备分离功能。 分析混合物最有力的手段,2、色谱法的特点 （1）分离效率高 （2）应用范围广 （3）分析速度快。 （4）样品用量少 （5）灵敏度高 （6）分离和测定一次完成，可以和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用,三、色谱法的分
2、类,（一）按两相物理状态分,气相色谱法 (gas chromatography 简称 GC) ：用气体作流动相的色谱法。气液色谱法 GLC 气相色谱法气固色谱法 GSC,液相色谱法 (liquid chromatography 简称 LC) ：用液体作流动相的色谱法。液-液色谱法 LLC 液相色谱法液-固色谱法 LSC,超临界流体色谱法 (SFC)：用超临界状态的流体作流动相的色谱法。超临界状态的流体不是一般的气体或流体 , 而是临界压力和临界温度以上高度压缩的气体 , 其密度比一般气体大得多而与液体相似 , 故又称为 “ 高密度气相色谱法,（二）按分离原理分,1、吸附色谱法（ adsorpt
3、ion chromatography ）根据吸附剂表面对不同组分物理吸附能力的强弱差异进行分离的方法。2、分配色谱法 （partition chromatography ）根据不同组分在固定相中的溶解能力和在两相间分配系数的差异进行分离的方法。,3、离子交换色谱法（ion exchange chromatography ）根据不同组分离子对固定相亲和力的差异进行分离的方法。,4、排阻色谱法（ size exclusion chromatography） 又称凝胶色谱法 （gel chromatography ）根据不同组分的分子体积大小的差异进行分离的方法。其中：以水溶液作流动相的称为凝胶过滤
4、色谱法 ；以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱法 5、亲和色谱法 (affinity chromatography)利用不同组分与固定相共价键合的高专属反应进行分离的方法,（三）按固定相的形式 1. 柱色谱法（column chromatography ） 填充柱色谱法 开管柱色谱法2. 平板色谱法 （planer chromatography ） 纸色谱法 薄层色谱法,四、色谱流出曲线和术语,（一）色谱流出曲线,（二）术语 1、基线(base line)： 2、死时间 t0（tM)（dead time）： 3、死体积 V0（dead volume ）：V0 = t0F0,4、保留值： （1）
5、保留时间 tR （retention time） （2）调整保留时间 tR（adjusted retention time） （3）保留体积 VR （retention volume） （4）调整保留体积 VR（adjusted retention volume,保留值与固定相和流动相的性质、固定相的量、柱温、流速和柱体积有关,（5）相对保留值 r21（relative retention value）：,特点：只与温度和固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速等其它色谱操作条件无关，与色谱柱无关，反映了色谱柱对待测两组分1和 2 的选择性。是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使
6、用的定性数据,5、峰高（h） 6、色谱的区域宽度（peak width） （1）标准偏差 （standar deviation） （2）半(高)峰宽 W1/2（peak width at half-height）（3）峰宽或称Wb,Wb = 4 = 1.699 W1/2,最后从色谱图上得到以下信息： 峰的数目，判断样品中所含组分的最少个数 根据峰的保留值进行定性分析 根据峰面积或峰高进行定量分析 根据保留值和峰宽，判断色谱柱的分离效能 由两峰间的距离，判断评价固定相和流动相选择是否合理。,第二节 气相色谱分析理论基础,1、气-固色谱分析的基本原理,一、气相色谱分析的基本理论,由于吸附剂固定相对
7、各组分的吸附能力的差异，在经过吸附、解吸、再吸附、再解吸。吸附力弱的组分先流出柱子，吸附能力强的后流出柱子。,2、气液色谱分析的基本原理,试样被分离的基本原理是分配过程 ： 第一步：将固定相装入色谱柱后，组分被载气带入柱中，到达固定相表面时，溶解在固定液中 溶解过程 第二步：随着载气不断流动，组分又从固定相中挥发出来，重新进入流动相-载气 挥发过程 第三步：挥发进入载气的组分随着流动相的不断流动，再次溶解在固定相中 再溶解过程 第四步： 再挥发过程,3、分配系数K（distribution coefficient）,无因次量，由组分及两相的热力学性质决定，只随柱温、柱压而变化,结论： 一定温度
8、下，各组分在两相间的 K 不同 ，在色谱柱中的移动速度不同，使得原来K 仅有微小差异的各组分在经过反复多次的分配后，产生很大的分离效果 K小的组分，较早 流出色谱柱 K大的组分，较晚 流出色谱柱,K：色谱分离的依据,4、分配比 k（partition ration）(分配容量或容量因子),k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温及柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关,5、分配系数(K) 和分配比 k 的关系,令：,色谱柱的相比,结论： K及k是和组分、固定相的热力学性质有关的参数，它们随柱温、柱压的变化而变化 K由组分和两相性质确定，和两相（固定相、流动相）体积无关k值和组
9、分、两相性质有关外，还和相比有关 K及k是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数,6、K 和k 与tR 的关系,k 值越大 tR越长,K 与tR的关系,tR= k t0 =K t0 Vs/Vm,要使各组分分离，它们的tR必须不同，而tR是由两组分的 K 或 k 决定,7、分配系数比（分离因子）,大于1是分离的先决条件,二、色谱分离的基本理论,气相色谱法是利用混合物中各组分在两相中的分配系数或吸附系数的不同而进行分离的。要使各组分实现有效的分离，必须考虑两方面的问题： 第一：热力学问题提出了塔板理论 第二：动力学问题提出了速率理论,（一）塔板理论,1、理论假定： （i）在柱内一小段长度H内，组分可以
10、在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）,（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略 （iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关,为简单起见，设色谱往由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编 号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1.m=1（例1mg或1g）,2、柱效能指标(n、H ) 理论塔板数N组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数理论塔板高度H为使组分在柱内两相间达到 一次分配平衡所需要的柱长,讨论：,
11、不同组分，理论塔板数 不同n为无量纲值，计算时上下单位保持一致,有效（理论）塔板数（neft）,有效塔板高度 Heft,组分能否分离，主要取决于各组分在两相间K 的差异，而不是决定于分配次数的多少。柱效高只能说明组分在两相中交换次数多,塔板理论的贡献：从热力学角度 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置 阐明了保留值与K的关系 提出了评价柱效高低的n和H的计算式,例： 色谱柱长为2m，固定相为5%的阿皮松，分离柱温为1000C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数。,（二）速率理论,塔板理论成功处： 解释了色谱流出曲
12、线的形状和浓度极大值对应的tR 阐明了保留值与K的关系 评价柱效（n，）,塔板理论存在问题: 1）做出了四个与实际不相符的假设忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程 2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的影响因素 3）排除了一个重要参数流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速关系更无法提出降低板高的途径,速率理论：吸收了塔板理论的有效成果H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素,1. 涡流扩散项（多径扩散项）：A,产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力路径不同涡流扩散,影响因素：固体颗粒越小，填充越实，A项越小,讨论：,气相色谱中，粒度很小时，柱阻大，且不易填匀，因此
13、一般采用粒度为60-80目或80-100目的填充物较好。（空心毛细管柱的A项为零）,2、纵向分子扩散项 Bu 产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开 两边浓度差,纵向扩散项系数弯曲因子，亦称阻碍因子，由于固定相颗粒的存在使扩散受阻，填充柱1，硅藻土单体为0.50.7，毛细管柱 1Dg组分在流动相中的扩散系数（cm2/s）,措施：为降低纵向扩散，宜选择分子量较大的载气（如N2）、较低的柱温、较高的u以减小Bu,选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选M较大的N2气（粘度大）u 较大时，选M较小的H2气，He气（粘度小）,注意 和（填充物的不均匀因子和弯曲因子）的区别： 填
14、充物填充不均匀造成载气流动的路径不同 由填充物对分子扩散造成的阻碍而引入的校正系数。,3、传质阻力项 Cu C u =（Cm+ Cs）u Cm气相（流动相）传质阻力系数，指试样组分从流动相扩散到 固定相界面进行质量交换过程中所受到的阻力 Cs液相（固定相）传质阻力系数，为组分从两相界面扩散到固定相内部达到分配平衡后又返回到两项界面时受到的阻力,（1）气相（流动相）传质阻力项 （Cm u）,当组分在两相间进行质量交换，即进行浓度分配,有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。采用
15、细颗粒的固定相、增大Dg、适当降低流动相线速度等均可使流动相传质阻力减小。,（2）固定相（液相）传质阻力项（Cs u）,讨论： 降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cs增大。 当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，一般可采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。 提高柱温可增大DL，但会使k值减小，为了保持适当的Cs值，应控制适宜的柱温。,4、速率理论方程,小结：范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中，填充均匀程度、填充物的粒度、流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响,5、影响色谱带展宽的其他因素,（1） 非线性色谱,非线性等温线 （1）凸形拖尾峰固定相表面吸附中心活性不均，K不同.先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小 （2）凹形前沿峰溶质与固定相作用，改变其表面性质,K随着溶质浓度的增加而增加,（2）活性中心的影响由于载体表面不完全惰性，即使涂布少量固定液后，在它表面存在的活性中心 (如酸或碱作用中心)对极性强的组分仍会产生吸附，使这些组分释放的速度慢于 其他分子而造成拖尾。解决办法:将载体预处理，除去或减少这些活性中心,（3）柱外效应较大的气化器体积柱前后死体积 连接管体积检测器死体积等进样速度慢 与进样有关的技术 进样量大 气化温度不够高等,
