1、1.2 基因工程的基本操作程序,1.明确如何从基因文库中获取目的基因及理解PCR扩增目的基因的方法。 2.理解基因表达载体的构建是基因工程的核心。 3.掌握将目的基因导入受体细胞的方法。 4.促进目的基因的检测与鉴定。,课前自主学案,一、目的基因的获取 1.目的基因：指编码蛋白质的 _。 2.获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因 基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入 _的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因文库的种类 基因组文库：含有一种生物的所有基因 部分基因文库：含有一种生物的一部分基因,结构基因,受体菌,（2）利用P
2、CR技术扩增目的基因 PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 条件：已知基因的_。 过程：目的基因受热解链形成 _，与引物结合，在DNA聚合酶的作用下延伸形成DNA。 方式：指数扩增=2n(n为扩增循环的次数) （3）人工合成法：若基因较小、核苷酸序列已知，可以人工合成。,核苷酸序列,单链DNA,二、基因表达载体的构建 1.表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+_。 2.表达载体的功能 （1）使目的基因在_中稳定存在，并且遗传给下一代。 （2）使目的基因表达和发挥作用。 3.启动子：位于基因的首端，它是_识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。 4.终止子：位
3、于基因的尾端，终止_。 5.标记基因：_是否含有目的基因。,标记基因,受体细胞,RNA聚合酶,mRNA的转录,鉴别受体细胞中,三、将目的基因导入受体细胞 转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 1.将目的基因导入植物细胞的方法 （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染_植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力；Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 转化过程：目的基因插入到Ti质粒的T-DNA进入 农杆菌导入植物细胞 稳定维持和表达。 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法,双子叶,2.将目的基因导入动物细胞的方法 （1）
4、方法：显微注射技术。 （2）操作程序：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵发育 新性状动物。 3.将目的基因导入微生物细胞的方法 （1）原核生物特点：繁殖快、多为_、遗传物质相对较少。 （2）转化方法：Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子。,单细胞,四、目的基因的检测与鉴定 1.检测 （1）方法：采用_技术、抗原抗体杂交技术。 （2）内容： 检测转基因生物的_上的目的基因。 检测目的基因是否转录_。 检测目的基因是否翻译_。 2.鉴定：个体生物学水平鉴定、抗病鉴定等。,DNA分子杂交,染色体DNA,mRNA,蛋白质,1.基因工程的正
5、确操作步骤是（ ） 使目的基因与载体相结合 将目的基因导入受体细胞 验证目的基因的表达是否符合特定性状要求 提取目的基因 A. B. C. D. 解析：选C。在基因工程操作中，首先要提取目的基因，然后使目的基因与载体结合，再将目的基因导人受体细胞，最后是目的基因的检测与表达。,2.PCR技术扩增DNA，需要的条件是（ ） 目的基因引物四种脱氧核糖核苷酸耐高温的DNA聚合酶mRNA核糖体能量 A. B. C. D. 解析：选D。错误地把PCR技术扩增DNA的过程认为是DNA复制的过程，DNA复制的过程需要模板、原料、酶、能量，故误选B。,3.科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力
6、，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。,科学家又在有启动子、抗虫基因的 质粒中插入终止子(抗虫基因末端)， 导人棉花受精卵，结果长成的植 株才有了抗虫能力。由以上过程 推知，作为目的基因的载体 应具备的结构是（） A.目的基因、启动子 B.目的基因、终止子 C.目的基因、启动子、终止子 D.目的基因、启动子、终止子、标记基因 答案：D,4.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才
7、能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（） 检测受体细胞是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录mRNA 检测目的基因是否翻译蛋白质 A. B. C. D.,解析：选C。目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交。检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交。最后检测目的基因是否翻译了蛋白质。方法是进行抗原抗体杂交。,5.下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：（1）在基因工程中，AB为_技术，利用的原理是_，其中为_过程。 （2）BC为抗虫棉的培育过程，其中过程
8、常用的方法是_。要确定目的基因（抗虫基因）导入受体细胞后是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体生物学水平上的鉴定过程：_。,解析：在基因工程中，AB为DNA扩增过程，又称PCR技术，利用的原理是DNA分子复制，其中为解旋过程；BC为抗虫棉培育过程，过程为将目的基因导入细胞的过程，常用方法为农杆菌转化法。 答案：（1）PCR DNA分子复制 DNA解旋 （2）农杆菌转化法 让害虫吞食转基因棉花的叶子，观察害虫的存活情况，以确定是否具有抗虫性状,课堂互动探究,【特别提醒】PCR技术不需要解旋酶，但需利用9095高温使DNA分子解旋。 PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸
9、序列，以便根据这一序列合成引物。,1.基因表达载体的构建 （1）目的基因是指 编码蛋白质的 结构基因，没有 启动子，若只将 目的基因导入 受体细胞中无法转录。,（2）目的基因的表达需要调控序列，因而用做载体的质粒插入目的基因时须有启动子，插入后须有终止子。 （3）目的基因是否导入受体细胞中，需要有筛选标记标记基因。 因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、 终止子、目的基因、标记基因。 【特别提醒】终止子是指DNA分子上决定转录停止的三个相邻碱基；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。,2.目的基因导入受体细胞,（1）不同生物的受体细胞不同：植物为体细胞，动物一般为受精
10、卵，微生物一般为大肠杆菌。 （2）上图中发生与发生相比，会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。,3.目的基因在受体细胞中表达，产生相应性状的原因是不同的生物共用一套遗传密码。 目的基因的检测内容和方法的比较,1.为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？（教材P9） 答案：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，但并不是唯一的方法。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中直接获得，
11、也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？（教材P11） 答案：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无
12、法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,（2010年青岛市高二质检）如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoR、Bam H的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、Bam H在内的多种酶的酶切位点。 据图回答：,(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_ 、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_。,(2)用上
13、述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_。,(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。 (4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。,【解析】（1）将含有目的基因的DNA与质粒用EcoR酶切开后，可形成许多有相同末端的DNA片段，再用DNA连接酶连接起来后，可形成目的基因与目的基因、目的基因与载体、载体与载体连接的重组DNA分子，而基因
14、工程所需要的是目的基因与载体的连接物，所以对以上三种DNA分子片段进行分离提纯，以获得基因工程所需要的。,(2)质粒是原核生物细胞中的一种DNA分子，所以对以上连接物，只有载体与载体的连接物能生活在原核生物宿主细胞内。而目的基因与载体连接物、载体与载体的连接物都含有完整的青霉素抗性基因，所以可生活在含有青霉素的培养基上。 (3)目的基因表达时，RNA聚合酶与启动子结合，催化DNA分子转录为信使RNA分子。,(3)目的基因表达时，RNA聚合酶与启动子结合，催化DNA分子转录为信使RNA分子。 (4)为了防止目的基因与质粒表达载体的任意连接，可同时选用EcoRI酶与BamHI酶切割目的基因和质粒，
15、这样形成的目的基因两个末端分别有不同的核苷酸序列，而质粒的两个末端也是分别有不同的核苷酸序列，这样就能保证目的基因只能与质粒结合了。,【答案】(1)目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物分离纯化 (2)载体载体连接物目的基因载体连接物、载体载体连接物 （3）启动子mRNA （4）EcoR和BamH,【易误警示】切割质粒和目的基因的限制酶必需是同一种酶，以获得互补的黏性末端，利于重组质粒的构建。 插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。,（广东高考）天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用做发酵原料的淀粉需经一系
16、列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题： (1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是_，用_将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子_，以完成工程菌的构建。,(2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是_；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用_检测。将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一段时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈，请解释该现象发生的原因_。 (3)如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小? (4)微生物在基因工程领域中
17、有哪些重要作用?,【解析】该题主要考查了基因工程的过程及应用。 （1）基因工程中的工具酶是限制酶和连接酶。两者作用相反，限制酶能把目的基因和载体切割出相同的末端，而连接酶能把被切割的目的基因和载体通过形成磷酸二酯键连接起来，形成新的DNA分子。重组的DNA分子必须经过一定的方法导入受体细胞，最终得到含有目的基因的工程菌。 （2）要鉴定工程菌中是否含有目的基因，可以利用DNA探针通过DNA分子杂交原理检测的目的基因是否存在。如果要检测目的基因是否表达，可采用抗原抗体杂交原理，检测特定蛋白质是否存在。,（3）将不同的工程菌分别接种在含有等量的淀粉的固体培养基上，一定时间后，加入碘液，不显蓝色的透明
18、圈就是淀粉被分解的地方，透明圈越大，说明工程菌分解淀粉的能力越强。 （4）微生物体积微小、代谢速率快，常作为受体细胞来接受目的基因，经过代谢来生产大量相应的产物；微生物种类繁多，很多具有侵染性，可用来作为导入受体细胞的媒介；微生物中含有多种限制酶，为基因工程的操作提供工具。,【答案】（1）限制酶（限制性核酸内切酶）DNA连接酶导入受体细胞 （2）DNA分子杂交技术抗原抗体杂交 出现透明圈是因为淀粉被淀粉酶水解了，说明淀粉酶基因已经翻译成淀粉酶。 （3）可将不同的工程菌分别接种到含有等量的淀粉的固体培养基上，一段时间后，加入碘液，不显蓝色的透明圈就是淀粉被分解的地方，透明圈越大，说明工程菌分解淀
19、粉的能力越强，从而可确定转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小。 （4）作为受体细胞，获取限制酶等。,【归纳总结】（1）在不同层次上目的基因的检测和鉴定可以概括为：（2）在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是标记的DNA分子。,分子杂交,判断,随堂即时检测,课后反思淘金,1.cDNA文库是利用mRNA反转录合成的目的基因，该目的基因中不含有启动子和内含子，而基因文库中含有启动子和内含子。 2.目的基因必须与基因运载体结合形成基因表达载体才能进入受体细胞，基因表达载体必须具备启动子和终止子才能在宿主细胞内正常表达。 3.农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，因为这些植物受损后分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌感染受体细胞，而单子叶植物不能分泌酚类化合物，所以农杆菌不感染单子叶植物。 4.DNA分子杂交的原理是碱基互补配对。,
