1、基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,1.目的基因的获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RN
2、A，不能编码蛋白质。,能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,知识点一：2.真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细
3、胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,知识点二.基因工程基本操作的四个步骤,一、获取目的基因,1.获取目的基因的途径A.从自然界已有的物种中分离B.人工合成 2.获取目的基因的方法A.从基因文库中获取B.利用PCR技术扩增C.利用化学方法人工合成,目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：概念见P9,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因
4、组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,3.基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,4.获取目的基因的根据：,见课本P9,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,5.基因文库的构建方法之一,（1）直接分离法(鸟枪法),cDNA合成过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链D
5、NA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,5.基因文库的构建方法之,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,2、利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),Mg2+(激活剂),条件：,缓冲溶液,一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,前提：,利用PCR技术扩增目的基因,原理: DNA双链复制前提: 要有一段
6、已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。,过程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）,重复循环,预变性（增加DNA变性的概率）,2、具体过程,PCR(多聚酶链式反应), 概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,过程：
7、,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：以目的基因转录成的信使R
8、NA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,1、目的：所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋
9、白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三、将目的基因导入受体细胞-植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,易感染双子叶植物和裸子植
10、物，对大多数单子叶植物没有感染能力,将目的基因导入受体细胞-动物细胞,显微注射法,将目的基因导入受体细胞-微生物细胞,Ca2+处理使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA-感受态细胞,四、目的基因的检测与鉴定,检测: 是否插入目的基因（DNA分子杂交技术） 是否转录（mRNA分子杂交技术） 是否翻译（抗原抗体杂交技术） 鉴定: 功能活性鉴定 抗性鉴定,分别提取什么进行检测,归纳步骤,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,
11、归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,基因操作的基本步骤,基因操作的基本步骤,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕
12、地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,1）以下说法正确的是 （ ）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必
13、须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 （ ）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,
