1、1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,在这三种方法中，哪些方法是要求知道基因的核苷酸序列的？,要求知道基因的核苷酸序列,1、从基因文库中获取目的基因,（1）.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
2、如：cDNA文库,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上游有RNA聚合酶结合位点:,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合
3、酶结合位点(启动子)。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,与RNA聚合酶结合位点,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,1下列关于基因结构的认识中，正确的是 （ ） A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列 B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子 C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游 D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列 2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是 （ ） A编码区都有能编码蛋白质的序列 B编码区都是连续的 C非编码区都能调控遗传信息的表达 D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,提取
4、某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（2）.基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存, cDNA文库的构建-逆转录法：,mRNA,RNADNA杂合双链,单链DNA,双链DNA,逆转录,（cDNA）,DNA聚合酶,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有
5、关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库 （cDNA文库）,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物某个时期的mRNA,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下
6、，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,2
7、、利用PCR技术扩增目的基因,(1)概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,PCR技术,(2)原理： (3)前提： (4)原料：(5)优点(6)过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,变性,复性,延伸,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶
8、的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,这是在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库
9、,课堂小结：,1、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,二、基因表达载体的构建（核心）,为什么要构建基因表达的载体？,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,2.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,Hin d限制酶,目的DNA,质粒,构建表
10、达载体,四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因,DNA连接酶,人类胰岛素的基因,选择带两个标记基因的质粒有什么目的？,思考：作为基因工程表达载体， 只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,2.基因表达载体的组成：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。启动子、终止子：对于目的基因表达必不可少。目的基因不
11、能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。基因表达载体的构建不可能是千篇一律的,注意,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 真核生物：酵母菌和动植物细胞,三、将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是
12、利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,常用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注
13、射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,小结：将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,想一想：用各种方法进行导入时，导入的是目的基因还是表达载体？
14、,（一）、检测（分子水平）,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 .使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,四、目的基因的检测与鉴定,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,（1）方法:,分子杂交,方法:,抗原抗体杂交,（2）过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的
15、基因转录出了mRNA,小结：目的基因的检测与鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶
16、脱氧核苷酸的个数是（ ）个,A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560,加热至95摄氏度的目的是使DNA中的 断裂，这一过程在细胞内是通过 解旋酶 的作用来完成的。 当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料 ，遵循的原则是 。 Taq酶的特点是（ ）A.耐强酸 B.耐强碱C.耐高温 D.最适温度37摄氏度 4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别,在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为
17、模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温 A B C D,D,在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个,B,在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法
18、通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,A,D,目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A B C D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,1、基因工程中科
19、学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基
20、因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质A B C D,C,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A B C D,C,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用
21、于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、
22、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到 A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接 B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增 C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状 D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,
