1、1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,也有一些具有调控作用的因子,2、获取目的基因的方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,_,(一)从基因文库中获取目的基因,1.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,2.基因文库的分类:,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生
2、物的部分基因，如：cDNA文库,基因文库的构建过程,通过对受体菌群体的培养而储存一种生物的全部基因。,基因组文库,3.基因文库的构建方法,提取生物某发育时期的mRNA,单 链DNA,逆转录酶,DNA聚合酶,双链CDNA (只含该生物部分基因),与载体连接导入到受体菌群储存,cDNA文库,基因组文库和cDNA文库比较,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（
3、补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,真核生物mRNA的形成,编码区,非编码区,RNA聚合酶结合位点,非编码区,转录,加工（剪切、拼接）,成熟mRNA,只对应外显子部分,初级转录物,补充资料,基因组文库和cDNA文库比较,依
4、据：目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,4.从基因文库中得到目的基因的方法,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_ 、 _ 、_,原理：_,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,模板DNA,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,（二）利用PCR扩增目的基因,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：_,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内大量扩增,过程,a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（复性55
5、-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,前提_,有一段已知目的基因的核苷酸序列,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成（DNA合成仪）,（三）人工合成,若基因_，核苷酸序列_ ，可用此法。,较小,已知,（化学合成法）,mRNA,cDNA单链,cDNA分子,逆转录酶,DNA聚合酶,（三）人工合成,（反转录法）,与直接提取的DNA相比cDNA不含有_和_等结构。,真核生物mRNA的形成,编码区,非编码区,RNA聚合酶结合
6、位点,非编码区,转录,加工（剪切、拼接）,成熟mRNA,只对应外显子部分,初级转录物,补充资料,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,1、基因表达载体的构建目的,二、表达载体的构建,2、基因表达载体的组成：,目的基因,标记基因,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,用一定的_切割质粒，使其出现
7、一个切口，露出_。用_切断目的基因，使其产生_。,3、基因表达载体的构建,将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(插入式),用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。用_切断目的基因，使其产生_。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之露出相同的黏性末端，在加入DNA连接酶。,三、将目的基因导入受体细胞,将目的基因
8、导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca+处理法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,农杆菌特点：,（1）农杆菌转化法,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上,2、将重组Ti质粒导入农杆菌,3、用农杆菌感染植物体细胞,（2）基因枪法,适用于 单子叶植物,（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法 程序：,取卵,显微注射,受精卵,早期胚
9、胎培养,胚胎移植,3、将目的基因导入微生物细胞,用Ca2+处理细胞,原核生物特点：,繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,感受态细胞,四、目的基因的检测与鉴定,四、目的基因的检测与鉴定,抗原抗体杂交法,分子杂交法,DNA分子杂交法,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,方法,检测对象,结果,个体水平的鉴定,是否显示出杂交带,四、目的基因的检测与鉴定,个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性状）,1、鉴定转基因抗虫棉是否具有抗虫性可采用_ 实验,2、如何鉴定转基因抗盐烟草是否成功？,接虫,在转基因抗盐烟草田中浇灌盐水，观察其 是否有抗
10、盐特性,3、用乳腺生物反应器生产人血清白蛋白，如何确定转基因羊培养成功？,检测羊乳中是否含有人的血清白蛋白,基因探针：（制作探针的要求）, 含有目的基因, 单链, 标记放射性同位素或荧光,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR技术 人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：是否有转基因特性,一、乳腺生物反应器,1.目的基因是什么？,药用蛋白基因,2.目的基因前需加的什么启动子？,乳腺蛋白基因的启动子,3.受体细胞是
11、什么？,受精卵,4.分泌蛋白质的细胞是？,乳腺分泌细胞,5.将目的基因导入受体细胞的方法？,显微注射法,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱 生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科 学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可 以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：,1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞， 常用方法是_。,显微注射,2）进行基因转移是，通常要将外源基因转到 _中，原因是 ：,受精卵, 具有发育的全能性；, 体积大，易操作。,3）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在 小鼠的_细胞中特异表达。,膀胱上皮,练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱 生物发生器的研究也
12、取得了一定进展。最近，科 学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可 以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：,4）通常采用_技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组,DNA分子杂交,6）与乳腺生物反应器相比，膀胱反应器有什么优点？, 不受性别的限制；, 没有是否处于生殖期的限制。,5）检测人的生长激素是否成功表达可采用_ 技术,抗原-抗体杂交,1、基因治疗概念：,二、基因治疗曙光初照,将健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。（增补策略）,2、基因治疗的类型,3、基因治疗的发展现状：,处于初期的临床试验阶段,三、蛋白质工程的崛起,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提：,了解蛋白质的结构和功能,途径：,目的：,改造基因（基因修饰或基因合成）,定向改造或制造蛋白质,获得自然界没有的蛋白质,1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。,
