1、基因工程的基本操作程序,1、基因工程包括哪些步骤？,3、基因工程中的核心环节是哪一步？,4、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？,5、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？ 如何检测和鉴定？,2、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？,思考讨论问题：,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,主要是指编码蛋白质的基因,(一）目的基因,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,一、目的基因的获取,（二）获取目的基因的方法,1、从基因文库中直接获取,2、PCR
2、技术扩增,3、化学方法直接人工合成,1、从基因文库中直接获取,（1）基因文库的概念,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,含有一种生物的全部基因,只包含了一种生物的部分基因，如:cDNA文库,（2）基因文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,方法一：直接分离法,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与运载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,方法二：反转录法-cDNA的
3、合成流程图解,PCR技术多聚酶链式反应,PCR扩增仪,DNA半保留复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA,2、利用PCR技术扩增目的基因,原理：,前提：,条件：,利用PCR技术扩增目的基因,高温变性,1.目的基因DNA受热变性，解链；,2.引物与单链互补结合；,3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,3、人工合成, 核心,二、基因表达载体的构建,功能：使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。,基因表
4、达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,编码区,非编码区,非编码区,启动子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱
5、离下来，使转录终止。,终止子,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,A G G T C A C G T C G,T C C A G T G C A G C,RNA聚合酶,A G G U C A C G U C G,基因表达载体的组成：,b、目的基因,a、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,1、下列属于获取目的基因的方法的是利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.,小试牛刀,2、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题
6、。 (1)此图表示的是采取_合成基因的方法获取_基因的过程。 (2) 图中DNA是以为_ _ 模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。,人工,目的,控制胰岛素合成的信使RNA,小试牛刀,(3) 图中代表 ， 它往往含 基因，以便对 目的基因的检测。,重组DNA分子,标记,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、目的基因导入受体细胞,将目的基因导入植物细胞的方法,1、农杆菌转化法,2、基因枪法,3、花粉管通道法,土壤农杆菌转化法示意图,将目的基因导入动物细胞
7、的方法,显微注射法,将目的基因导入微生物细胞方法,宿主细胞（大肠杆菌）,感受态细胞（大肠杆菌）,Ca2+,四、目的基因的检测与鉴定,首先：其次：最后：还要：,要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因,DNA分子杂交技术 分子探针,检测目的基因是否转录出mRNA,检测目的基因是否翻译出蛋白质,个体生物学水平的鉴定,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应
8、的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,3（2010江苏高考，27题，8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。,0、2,（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。 （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是 。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。 （5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。 （7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。,高,Sma破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因,质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,DNA连接,鉴别和筛选含有目的基因的细胞,蔗糖为唯一含碳营养物质,
