1、科研论文格式一、开题报告：1.选题意义2.国内外文献综述3.写作框架：三段论：问题； 原因；对策、建议、措施4.正文：标题： 不能超过 20个汉字，超过后要用副标题副标题：（以为例）或（据统计而得） 作者： 个作者为宜作者单位：单位全称，所在省 城市 邮政编码摘要： 用第三人称写法（不以“本文”、 “作者” 等为主语，可用“文章” ） ，200字之内关键词： 3-5个，中间用分号相隔英语翻译：翻译部分正文： 结构要严谨，表达要简明，语义要确切，论点要鲜明，论据要充分，引用要规范，数据要准确，层次不宜过多，层次序号为：一、 （一） 、1、 （1） 、1） 参考文献：文献类型标识，如专著：M ；论
2、文集：C；报纸文章：N；期刊文章：J ；学位论文： D；报告：R；标准：S ；专刊： P；统计年笺：Za 论文集格式：作者题名文献类型标识 编者文集名出版地：出版者，出版年b 期刊文章格式：主要责任者题名 文献类型标识刊名，年，卷（期） c 报纸文章格式： 主要责任者题名文献类型标识 报纸名，出版日期（版次） d 网站格式：URL 网址名称同一专著、论文集、期刊、报纸文章，都一律只用一个序号，而且要把页码统一标注在文章中相应序号之后。作者简介：作者姓名（出生年 ） 、性别、民族（汉族可省略） ，籍贯（省、市或县） 、现供职单位全称及职称、学位、研究方向、联系方式二、论文级别：1.一般刊物：省级
3、、国家级2.核心刊物：省级、国家级SCIScience Citation Index （科学引文索引） SSCISocial Sciences Citation Index （社会科学引文索引） CSSCIChinese Social Science Citation Infoemation （中文社会科学引文索引） EIThe Engineering Index （工程索引） English Index(英文索引) 或(英文简缩)三、注释：用于对文内某一特定内容的解释或说明，其序号为：，注释置于页脚标题作者（单位全称，所在省 城市 邮政编码）【摘要】：【关科研论文格式写作 2008-05-0
4、6 10:17:52 阅读168 评论0 字号：大中小 一、开题报告：1.选题意义2.国内外文献综述3.写作框架：三段论：问题； 原因；对策、建议、措施4.正文：标题： 不能超过 20个汉字，超过后要用副标题副标题：（以为例）或（据统计而得） 作者： 个作者为宜作者单位：单位全称，所在省 城市 邮政编码摘要： 用第三人称写法（不以“本文”、 “作者” 等为主语，可用“文章” ） ，200字之内关键词： 3-5个，中间用分号相隔英语翻译：翻译部分正文： 结构要严谨，表达要简明，语义要确切，论点要鲜明，论据要充分，引用要规范，数据要准确，层次不宜过多，层次序号为：一、 （一） 、1、 （1） 、1
5、） 参考文献：文献类型标识，如专著：M ；论文集：C；报纸文章：N；期刊文章：J ；学位论文： D；报告：R；标准：S ；专刊： P；统计年笺：Za 论文集格式：作者题名文献类型标识 编者文集名出版地：出版者，出版年b 期刊文章格式：主要责任者题名 文献类型标识刊名，年，卷（期） c 报纸文章格式： 主要责任者题名文献类型标识 报纸名，出版日期（版次） d 网站格式：URL 网址名称同一专著、论文集、期刊、报纸文章，都一律只用一个序号，而且要把页码统一标注在文章中相应序号之后。作者简介：作者姓名（出生年 ） 、性别、民族（汉族可省略） ，籍贯（省、市或县） 、现供职单位全称及职称、学位、研究方
6、向、联系方式二、论文级别：1.一般刊物：省级、国家级2.核心刊物：省级、国家级SCIScience Citation Index （科学引文索引） SSCISocial Sciences Citation Index （社会科学引文索引） CSSCIChinese Social Science Citation Infoemation （中文社会科学引文索引） EIThe Engineering Index （工程索引） English Index(英文索引) 或(英文简缩)三、注释：用于对文内某一特定内容的解释或说明，其序号为：，注释置于页脚标题作者（单位全称，所在省 城市 邮政编码）【摘要
7、】：【关键词】：【英语翻译】：正文：【参考文献】【作者简介】自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究发表时间：2009-6-5 14:45:50 浏览次数：174 来源：中国创新医学网推荐蔡文君，谭长强，李玉瑾，黄和，李霜 南京医科大学第一附属医院 耳鼻咽喉科暨耳鼻咽喉科学研究室，江苏 南京 210029； 南京工业大学 生物化学中心，江苏 南京 210009【摘要】 目的：研究以重组复制缺陷型腺病毒为载体的 Fas 配体（FasLigand ，即 FasL）基因和白细胞介素10（即 IL10 ）基因治疗实验性自身免疫性感音神经性聋。方法：采用同种内耳组织抗原加弗氏佐剂免疫豚鼠，造成自身免疫性
8、感音神经性聋的动物模型28只，按配对设计将其分为4组，通过鼓阶微量注射的方式，A 组注入携带 FasL 基因的腺病毒（AdFasL ） ，B 组注入携带 IL10 基因的腺病毒（AdIL10 ） ，C 组单纯注入腺病毒（携带绿色荧光蛋白，即 AdGFP ） ，D 组注入等量的磷酸盐缓冲液。基因导入7 d 后行听觉脑干诱发电位（ABR）测试，后取颞骨制作石蜡切片并行 HE 染色和光镜观察，每组各取两耳行螺旋韧带和基底膜透射电镜观察。每组各取3只（6耳）行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和腺病毒转染情况。结果：免疫组织化学显示携带目的基因的腺病毒可以转染血管纹、螺旋韧带、Corti
9、 器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围及其耳蜗的骨壁等部位的细胞，并产生相应的蛋白产物（IL10 和 FasL） 。ABR波阈值的均值对比结果显示，A 组和 B 组明显低于 C 组和 D 组。内耳组织的免疫炎性反应亦明显较 C组减轻。结论：重组复制缺陷型腺病毒可以携带目的基因转导入内耳，并在内耳表达基因产物，其抑制炎症反应的作用可有效地减轻自身免疫性感音神经性聋的内耳组织免疫炎性损伤和听觉功能障碍，有望成为治疗自身免疫性感音神经性聋新的方法和途径。【关键词】 基因治疗； 自身免疫性感音神经性聋； 豚鼠1979年 McCabe 依据其临床发现，即18例听力障碍患者经过免疫抑制治疗后听力有明显改善，提出
10、了自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL)的概念。之后的进一步研究发现，自身免疫性损害不仅可累及耳蜗，还可波及前庭，故又提出了自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED） 12 概念。目前 ASNHL 的病因和发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性诊断方法，对于 ASNHL 患者的治疗亦存在着一些问题，主要是采用皮质激素或免疫抑制剂治疗，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。近年来随着分子生物学研究的深入和基因工程技术的进展，基因治疗已成为许多相
11、关疾病治疗研究方面的热点和新希望。基因治疗是根据特定的治疗目的基因将 DNA 导入到宿主细胞中并在其中表达。1996年Lalwani 等34 报道了将基因导入动物内耳，以后关于内耳的基因治疗成为一个热点，并在载体选择、导入方法和安全性评估等方面取得了很大的进步。基因工程技术已能构建特异性载体，可携带治疗基因导入动物耳内，在动物内耳获得高效表达4 ，产生具有高度生物活性的稳定的基因产物，并且不产生病毒相关的耳毒性反应，这为基因治疗感音神经性聋提供了生物学证据。目前因为复制缺陷性腺病毒载体具有病毒滴度高、转染效率高（100%） 、宿主细胞范围广、外源基因容量大、稳定和无插入突变危险等特点，已经成为
12、基因转导研究中应用最多的载体之一。Yagi 等5将腺病毒携带的 GDNF 基因从圆窗膜注射入鼓阶，GDNF 基因在蜗内得到表达并发挥作用。基于上述研究状况和现有研究工作基础，本项目组拟将利用基因治疗的独特性和内耳可行局部治疗的独特解剖特点，对自身免疫性感音神经性聋模型动物进行内耳免疫抑制或调节基因的试验性治疗研究，以探讨其治疗效果和可能发生的副反应情况。1 材料和方法1.1 实验动物健康成熟豚鼠，白色红目，体重300 g 左右，耳廓反应正常，耳镜检查排除中耳疾患，所有动物均由南京青龙山养殖场提供。1.2 内耳组织粗制抗原（crude inner ear antigens，CIEAgs）制备 豚
13、鼠 CIEAgs 制取方法参考文献4 ，主要步骤：将豚鼠清醒断头，取出颞骨，快速打开听泡，在解剖显微镜下分离全膜迷路，包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆囊和球囊（祛除耳石器） ，放入0.01 molL-1 pH 7.4 PBS 中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心（1 000 rmin-1，5 min）后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，分装后低温干燥制成 CIEAgs 干粉备用，保存于-80 冰箱。1.3 ASNHL 动物模型制备首次免疫每只动物采用 CIEAgs 400 mg（0.4 ml）-1，加等量完全弗氏佐剂，注射于右后足垫；2周后以 CIEAgs 200 mg（0.4
14、ml）-1加等量不完全弗氏佐剂，注射于背部多点皮下；间隔2周后，再同样强化免疫1次。依据听觉诱发电位波的阈值升高（超过免疫前全部动物均值加2倍标准差）和出现针对CIEAgs 特异性抗体（ELISA 法，波长490 nm 时 A 值超过免疫前全部动物均值加2倍标准差） ，判断为 ASNHL模型动物制备成功6 。1.4 实验设计ASNHL 模型动物共28只，按配对设计分为4组，每组7只：A、B 和 C 组分别向鼓阶内注入携带 FasL 基因的重组腺病毒(AdFasL) 、携带 IL10 基因的重组腺病毒(AdIL10) 和携带绿色荧光蛋白的腺病毒(AdGFP) ；D 组(即对照组)用同样方法仅向鼓
15、阶内注射磷酸盐缓冲液。1.5 重组基因载体鼓阶内注射末次免疫后2周进行。豚鼠用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30 mgkg-1）后，在耳廓后方作一长34 cm 弧形切口，显露听泡，用微型电钻打开 听泡，暴露耳蜗底转，用针尖轻轻磨薄耳蜗鼓阶侧壁的骨壁，钻一针尖大小的孔，用微推进器将小儿头皮针的针尖（针尖斜面已打磨变小）插入鼓阶，深度不超过1 mm，先抽取少量（约10 l）的外淋巴液，再用微量注射机将重组腺病毒或腺病毒液缓慢（1 lmin-1）注入鼓阶，A 组给予 AdFASL （病毒滴度为2.510 10 pfuml-1）20 l，B 组给予 AdIL10 （病毒滴度为1.0108 pfuml
16、-1）20 l，C 组给予 ADGFP （病毒滴度为1.0109 pfuml-1）20 l，D 组给予等量的磷酸盐缓冲液,骨蜡封闭耳蜗底转，抗生素冲洗中耳腔3次，部分局部放置氧氟沙星明胶海绵预防感染。骨蜡封闭听泡骨孔，逐层缝合伤口。所有操作应严格遵守无菌原则。1.6 特异性免疫反应测试采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定特异性抗体。分别于免疫前和末次免疫后2周进行。心脏采血，分离血清。用100 gml-1的 CIEAgs 溶液包被 ELISA 板，于4 过夜并封闭，加入110稀释的豚鼠血清37 下孵育2 h，洗板4次，加入12 000稀释的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白 A(Staphyl
17、ococcal protein AHRP ，SPAHRP ）37 下孵育1 h，洗板4次，以邻苯二胺 过氧化氢溶液为底物显色10 min 后用 H2SO4终止显色，在酶标仪下测定波长为490 nm 的吸光度 A 值。1.7 听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）测试 分别于免疫前、末次免疫后2周和鼓阶内注射后（1周） ，采用听觉诱发电位测试系统，豚鼠头顶冠状缝与矢状缝交界处插入针形电极作为测试电极，参考电极置于耳廓后方靠近乳突尖，接地电极置于对测乳突，刺激声信号采用 Click，重复频率为11次min-1，叠加2 048次，记录时程10 ms，测定波
18、的阈值、潜伏期和波幅。1.8 内耳光镜观察各组听觉测试后各取3只豚鼠，麻醉后断头，立即取出颞骨，打开听泡，放置于4%多聚甲醛固定液中，12 h 后换 EDTA 脱钙710 d，修剪后流水冲洗12 h，常规脱水、透明、浸蜡、定向包埋。耳蜗中轴切片，片厚5 m，漂片、捞片、粘片，常规 HE 染色，封片，光镜观察。1.9 免疫组织化学试验1.9.1 内耳石蜡包埋 各组于听觉测试后各取豚鼠3只，麻醉、断头，迅速取颞骨，打开听泡，放置于4%多聚甲醛固定液中，用针挑开圆窗，在蜗尖钻一小孔，快速灌注数次，固定12 h，采用 EDTA 脱钙710 d，修剪后流水冲洗12 h，常规脱水、透明、浸蜡、定向包埋。1
19、.9.2 免疫荧光化学试验 将 C 组2只动物的颞骨蜡块行耳蜗中轴切片，片厚5 m，漂片、捞片、粘片后常规脱蜡至水，在倒置荧光显微镜下观察和摄片。1.9.3 酶免疫组织化学试验 按上述方法获得切片，用胰酶（0.2%）修复抗原，余具体步骤：正常山羊血清封闭10 min,加 PBS 稀释的第一抗体（A 组加入兔抗鼠 FASL，B 组加入兔抗鼠 IL10 ，C、D 组加入兔抗鼠 FASL 和兔抗鼠 IL10 两种抗体） ，4 过夜，PBS 洗5 min3次，加入 HRP 标记的 SPA 作为二抗，37 孵育30 min，PBS 洗5 min3次，DAB 染色，封片剂封片，光学显微镜观察摄片。以上试剂
20、均购买自武汉博士德生物工程有限公司。1.10 内耳透射电镜观察各组听觉试验后各取1只豚鼠，麻醉后断头，迅速取出颞骨，经固定后取出全内耳膜迷路（螺旋韧带、血管纹） ，后固定、脱水、浸透、树脂定向包埋，聚合后修整包埋块，超薄切片，染色后透射电镜观察摄片。2 结 果2.1 特异性免疫反应试验结果见表1。结果显示：与免疫前相比，各实验组和对照组免疫后抗体水平均明显升高，差异有显著性（配对 t 检验，P0.05） 。免疫前和免疫后的各组间对比，未显示有显著性差异（配对 t 检验，P0.05） 。表1 各组血清中针对 CIEAgs 特异性抗体水平2.2 听觉功能以 ARB 的波反应阈作为评定听力水平的指标
21、，结果见表2。与免疫前相比，免疫后各组 ABR 平均阈值升高，差异均有显著性（t 检验，P0.05） 。与内耳抗原免疫后相比，A 组和 B 组内耳局部基因治疗后 ABR平均阈值降低，差异亦均有显著性（t 检验，P0.05） ；A 组平均阈值降低更为明显，但与 B 组相比差异无显著性（t 检验，P0.05） 。C 组和 D 组内耳局部给药前后对比，差异无显著性。各组内同期左右耳对比差异均无显著性（t 检验，P0.05） 。A 组和 B 组分别以其免疫后的 ABR 平均阈值减2倍标准差作为判断治疗后听觉功能改善标准，A 组有3只（5耳） 、B 组有2只（3耳）经局部基因治疗后听觉功能明显提高，治疗
22、有效率分别为35.71%（5耳/14耳）和23.08%（3耳/13耳） ，B 组1耳并发感染不计。同样分别以 C 组和 D 组免疫后的 ABR 平均阈值减2倍标准差作为判断治疗后听觉功能改善标准，内耳局部给药后，未发现有明显听力功能提高耳。表2 各组 ABR 测试结果2.3 内耳光镜观察结果见图1。C 组和 D 组出现较为显著的内耳组织炎症反应，包括：出现 Rosenthal 管中炎症细胞（以单个细胞为主）浸润，螺旋神经节细胞变少，耳蜗顶回骨壁内及血管纹有散在的黄色含铁血黄素颗粒，部分动物蜗管或鼓阶内可见絮状物沉积，蜗管内出现“漂浮细胞” 。Corti 器和血管纹未见明显异常。A 组和 B 组
23、的炎症反应明显较 C 组和 D 组为轻，尤其是听觉功能改善耳，仅在蜗轴血管周围有部分单个核细胞浸润，但螺旋神经节细胞数基本正常，Corti 器和血管纹未见明显异常。鼓阶内见部分絮状物，但未见“漂浮细胞”。2.4 免疫组织化学试验2.4.1 免疫荧光试验 见图2。结果显示：C 组见明显荧光显示的部位主要分布于耳蜗骨壁、骨螺旋板的蜗管内唇部、螺旋韧带和血管纹等部位。2.4.2 酶免疫组织化学 见图3。结果显示：A 组主要显色反应（即 FASL 表达）部位包括螺旋神经节、Corti 器、血管纹、蜗轴小血管周围、耳蜗骨壁以及壶腹嵴等。B 组主要显色反应（即 IL10 表达）部位包括血管纹、螺旋韧带、C
24、orti 器、螺旋神经节以及耳蜗的骨壁。C 组和 D 组仅在螺旋神经节和耳蜗骨壁有较弱的显色。2.5 透射电镜摄片结果各组显示均未出现特殊的细胞和细胞内结构的病理变化，仅见 C 组的1耳血管纹上皮细胞内部分线粒体肿胀（图4） 。3 讨 论目前 ASNHL 的发病机制尚不完全清楚，但对许多自身免疫性疾病的发生和病理变化研究中发现，部分细胞因子起着重要作用。已有实验表明,IL10 等免疫调节分子在自身免疫性疾病的预防和类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎及自身免疫性眼葡萄膜炎等动物模型的基因治疗中取得了良好的效果78 。我们已成功构建了 ASNHL 的动物模型9 ，本项实验研究采用豚鼠的
25、同种内耳抗原免疫后，成功地造成部分实验动物出现感音神经性聋和血清特异性抗体水平升高，即制成了 ASNHL 动物模型。再将重组腺病毒携带免疫调节分子基因（即抗炎症分子的基因 AdIL10 ）和干扰自身免疫反应信号传递过程并可导致细胞程序性死亡的分子基因（即调控细胞凋亡分子的基因 AdFasL ）采用鼓阶注射的方法导入豚鼠内耳，并于导入后7 d 测试实验动物的听觉功能、内耳组织中病毒转染和导入基因产物的表达情况。结果显示ASNHL 实验动物经内耳局部注射携带免疫调节基因的重组腺病毒后，部分实验动物的听觉功能明显提高，即ABR波阈值降低，组间阈值的均值对比，均较对照组有显著性差异。耳蜗病理组织形态学
26、观察发现两个实验组动物的内耳免疫炎性反应亦较对照组动物为轻，仅见部分实验动物出现蜗管内絮状物，未出现螺旋神经节细胞数量变化，Corti 器和血管纹形态基本正常，从而提示内耳局部的免疫调节基因治疗具有较好的效果，即调节和抑制了由于自身免疫所造成的内耳炎性反应和损伤，进而逆转和提高了听觉功能。内耳免疫组织化学试验结果显示，重组腺病毒可以成功转染豚鼠内耳，主要分布于耳蜗骨壁、骨螺旋板的蜗管内唇部、螺旋韧带和血管纹等部位。FasL 基因表达产物主要分布于螺旋神经节、Corti 器、血管纹、蜗轴小血管周围、耳蜗骨壁以及壶腹嵴等部位。IL10 基因产物主要分布于血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节以
27、及耳蜗的骨壁。基因产物表达于壳子、耳蜗血管纹、螺旋韧带、Corti 器、小血管周围。单一鼓阶内的一点注射可以较为广泛地分布于内耳各部位组织中，依据内耳解剖学和组织学特点，我们推测可能有3个途径使腺病毒从鼓阶分布到蜗管：（1）通过骨螺旋板下层中的小孔与鼓阶的外淋巴液相交通；（2）通过蜗神经纤维穿过的细孔与鼓阶的外淋巴液相交通；（3）鼓阶和前庭阶在顶回以蜗孔相交通，蜗管中的内淋巴液通过前庭膜与外淋巴液相交通。具体实际情况有待进一步研究和探明。另一有趣的现象是两个实验治疗组的动物免疫组织化学试验结果显示，在耳蜗的骨壁均有显著的病毒转染和免疫调节基因产物的表达，具体机制尚不清楚。依据本组在以往实验研究
28、中的发现，即同种内耳组织抗原免疫豚鼠后，部分实验动物的耳蜗骨壁内出现明显的炎性病灶10 （与骨硬化症的病变极为相似，从而支持该病的自身免疫性病因学假说） ，此次基因治疗的方法对于自身免疫性耳硬化症是否能发挥一定的治疗效果，有待进一步研究证实。此次实验研究中，我们对于一组 ASNHL 的实验动物鼓阶内单纯注射腺病毒后，结果显示听觉功能无显著变化，内耳病理形态学改变与内耳局部注射缓冲液的对照组相似，即提示腺病毒对于 ASNHL 治疗无显著效果，但亦未造成进一步损伤。【参考文献】1McCABE B F.Autoimmune sensorineural hearing lossJ.Ann Otol R
29、hinollmyrgol,1979,88:585589.2McCABE B F.Autoimmune inner ear disease: therapyJ.Am J Otol,1989,10:196197.3LALWANI A K，WALSH B J，REILLY P G，et al.Development of in vivo gene therapy for hearing disorders : introduction of adenoassociated virus into the guinea pigJ.Gene Ther,1996,3:588592.4RAPHAEL Y，FR
30、ISANCHO J C,ROESSLER B J.Adenoviralmediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivoJ.Neurosci Lett，1996，207:137141.5YAGI M,MAGAL E,SHENG Z,et al.Hair cell protection from aminoglycoside ototoxicity by adenovirusmediated overexpression of glial cell linederived neurotrophic factorJ.Hum G
31、ene Ther,1999,20:813823.6杨湘宁,钟启明.同种内耳抗原免疫致豚鼠感音神经性聋的实验研究J.中华耳鼻咽喉科杂志，1992，27: 35.7De KOZAK Y，THILLAYEGOLDENBERG B,NAUD M C，et al.Inhibition of experimental autoimmune uveoretinitis by systemic and subconjunctival adenovirusmediated transfer of the viral IL10 geneJ.Clin Exp Immunol,2002,130:212223.8LIANG W,KARABEKIAN Z,XU Q H,et al.Bcell delivered gene transfer of human SAgIg fusion protein protects from experimental autoimmune uveitisJ.Clin Immunol,2006,118:3541.9谭长强,钟启明,曹银成,等.在自身免疫性感音神经性聋发病机理中内淋巴囊作用的实验研究J.耳鼻喉学报,1993，7: 153157.10谭长强.特异性体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋实验研究 J.东南大学学报:医学版，2007，26（5）：327332.
