1、中文摘要miR-744 在前列腺癌恶性进展中的作用及机制研究中文摘要前列腺癌是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤。在北美地区男性恶性肿瘤当中，前列腺癌的发病率最高并且死亡率仅次于肺癌。在我国，随着人口老龄化的加剧，生活方式的西化，前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为威胁我国男性健康的主要疾病之一。前列腺癌的具体病因尚不完全清楚。普遍认为前列腺癌的形成是一个多因素多阶段的过程。目前，前列腺癌根治性切除术是治疗局限性前列腺癌的主要手段，但是对于已发生转移或者术后复发的患者，通常采用内分泌治疗。研究表明，80%患者早期对雄激素剥夺治疗敏感，但是在18-30 个月的中位时间后，几乎所有患者的病变都将
2、逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。这一阶段的患者对于内分泌治疗以及放化疗均不敏感，病情变得难以控制并且更容易出现转移，进入了难以治愈的阶段，已成为晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。因此，探讨前列腺癌的进展机制以及寻找新的分子生物治疗靶点，对于延缓前列腺癌的恶性进展以及提高晚期肿瘤患者的生存率具有重要意义。近年来，microRNA （miRNA）在肿瘤中起到的作用受到了越来越多的关注。miRNA是一种单链的非编码小分子RNA，由长度19-25个核苷酸构成。不同物种间的miRNA具有高度保守性，是调控基因表达的重要分子。成熟的miRNA通过碱基互补配对的方式与编码基因的mRNA3非编码区（
3、3UTR） ，通过抑制转录起始或者降解mRNA的途径，在转录后水平抑制靶基因的表达。至今为止，已发现的miRNA 有数种，调控了人类基因组中大约一半的编码基因，并且miRNA的表达水平异常或功能紊乱密切影响了细胞的增殖、分化和凋亡以及肿瘤的发生、发展。目前，越来越多的研究表明miRNA在前列腺癌的恶性进展中扮演着至关重要的作用。本课题组通过临床相关性研究分析在激素依赖性前列腺癌患者标本与去势抵抗性前列腺癌患者标本中表达显著差异的miRNA，其中miR-744在去势抵抗东南大学博士学位论文性前列腺癌中的显著高表达，miR-744是一个最近被确定的肿瘤相关基因，在头颈部相关肿瘤、多发性骨髓瘤、胃癌
4、、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌的患者组织中均发现其表达水平的异常。然而，目前还未见关于miR-744在人前列腺癌中研究报道。基于这样的研究现状，本研究首先通过实时荧光定量PCR技术在前列腺癌的组织和细胞中验证miR-744的表达水平，并且通过miR-744表达失调的体内外功能实验，探讨miR-744在前列腺癌中的生物学功能。最后运用生物信息学和分子生物学相结合的手段以及结合荧光素酶报告基因实验，进一步探究miR-744在前列腺癌中发挥生物学功能的分子机制。为筛选前列腺癌的生物标志物以及今后寻找新的前列腺癌治疗靶点奠定坚实的理论基础。第一部分 miR-744 在前列腺癌组织中的差异表达
5、研究目的：随着我国人口老龄化的加剧以及临床诊断技术的进步，前列腺癌的发病率及检出率呈逐年上升趋势。前列腺癌早期大多为激素依赖性前列腺癌(ADPC)，雄激素剥夺治疗对大多数患者均有明显效果，但一般在经过 14-30 个月的中位时间后，几乎所有患者最终均转变为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，这一阶段的患者对内分泌治疗以及放化疗均不敏感，进入了难以治愈的阶段，并且疾病的进展十分迅速。目前，分子生物学方面的研究在临床上已经成为发现、诊断、治疗前列腺癌恶性进展的热点。miRNA 在转录后翻译水平调控编码基因的表达，影响细胞的增殖、凋亡、分化以及恶性肿瘤的发生、发展。本阶段研究通过 miRNAs 芯片表达
6、谱检测分析在 ADPC 患者组织标本与 CRPC 癌患者组织标本中显著差异性表达的 miRNA 并予以验证。研究方法：临床收集 16 例 ADPC 组织与 12 例 CRPC 组织在液氮中保存，取 3例 ADPC 组织与 3 例 CRPC 组织进行 miRNAs 表达谱芯片检测分析；并且采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）和原位杂交（ISH）分别在组织标本中予以验证。同时，下载美国纪念斯隆凯瑟琳癌症研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSKCC）数据库中前列腺癌患者的 miRNA 表达基因芯片数据后，利用统计学的方法分析差异表达的 mi
7、RNA 在前列腺癌中的诊断作用以及中文摘要与预后生化复发的关系。研究结果：miRNA 表达谱芯片检测分析发现在 ADPC 与 CRPC 组织中存在显著差异表达的 miRNA，其中 miR-744 在恶性程度较高的 CRPC 组织中较 ADPC显著高表达，并且通过 qRT-PCR 和 ISH 验证了 miR-744 在不同前列腺癌组织标本中的差异表达（P0.001） 。同时，对 MSKCC 数据库中下载的前列腺癌患者资料进行二次分析，Kaplan Meier 分析结果显示在 98 例前列腺癌患者中，以中位数为截点将前列腺癌组分为 miR-744 高表达组和 miR-744 低表达组，miR-74
8、4 高表达组的患者生化复发时间短（P0.0001） 。并且通过多因素 COX 回归分析得出 miR-744 是前列腺癌患者预后的独立危险因素。研究结论：通过上述研究结果我们发现 miR-744 在 CRPC 中的表达较 ADPC 中显著增高，随着前列腺癌的恶性进展而升高，提示 miR-744 能够用于诊断前列腺癌的恶性进展。关键词：前列腺癌；激素依赖性前列腺癌(ADPC)；去势抵抗性前列腺癌(CRPC) ；miR-744。第二部分 miR744 对前列腺癌细胞生物学功能的影响研究目的：前列腺癌的发生发展是一个多因素相互作用的复杂过程，涉及许多基因在不同时间节点的选择性表达。在第一部分中，我们通
9、过 miRNA 芯片表达谱分析结合 qRT-PCR 以及 ISH 检测验证了 miR-744 在 CRPC 组织中表达与ADPC 组织中相比显著升高，并且通过对国外数据库中结果分析后得出 miR-744 前列腺癌的预后密切相关。但 miR-744 在人前列腺癌中的具体作用尚无系统的相关功能实验验证报道。因此，miR-744 是否参与了前列腺癌的恶性进展，在前列腺癌由激素依赖向趋势抵抗这一转化过程中又扮演了怎样的角色，在本部分研究中，我们通过体外细胞功能实验以及体内裸鼠皮下成瘤实验，探讨miR-744 在激素依赖性前列腺癌细胞系以及去势抵抗性前列腺癌细胞系中对细胞凋亡比例、细胞增殖能力、细胞迁移
10、和侵袭能力以及裸鼠活体皮下成瘤能力的影响。研究方法：在激素依赖性前列腺癌细胞系（LNCAP）以及去势抵抗性前列腺癌东南大学博士学位论文细胞系（PC3 和 DU145） 中采用 qRT-PCR 实验检测 miR-744 的表达量。并且通过体外功能实验在 LNCAP、DU145 和 PC3 细胞中分别过表达与干扰 miR-744 表达后，通过 MTT 和低密度细胞集落形成实验检测 miR-744 对前列腺癌细胞增殖能力的影响；流式细胞技术检测 miR-744 对前列腺癌细胞凋亡能力的影响； Transwell 小室实验检测 miR-744 对前列腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。体内实验采用裸鼠皮下成
11、瘤实验进一步验证 miR-744 对不同前列腺癌细胞系（LNCAP 和 PC3）体内成瘤能力的影响，并通过 ISH 和免疫组化（IHC ）检测各组移植瘤体标本中 miR-744 以及 Ki-67、CD31/34、Caspase-3 等增殖凋亡以及血管生成相关基因的表达，进一步佐证 miR-744 对前列腺癌细胞增殖以及侵袭转移能力的影响。研究结果： qRT-PCR 实验结果表明 DU145 和 PC3 细胞中的 miR-744 表达水平与 LNCAP 细胞相比显著升高（P0.01） 。MTT 实验和低密度细胞集落形成实验结果均表明在 miR-744 表达量相对较低的 LNCAP 细胞中过表达
12、miR-744 后较对照组（NC 组）相比能够显著促进细胞的增殖能力 （P0.05） 。流式细胞仪检测结果发现过表达 miR-744 组与 NC 组相比能够显著降低 LNCAP 细胞凋亡的比例（P 0.05） 。在 Transwell 小室实验中，过表达 miR-744 后能够明显促进LNCAP 细胞的侵袭和迁移能力（P0.05） 。裸鼠皮下成瘤实验表明，过表达miR-744 组的细胞瘤体大小和体积明显大于对照组（P0.05） ，同时在皮下移植瘤体的病理切片中，免疫组化实验结果表明细胞增殖相关基因 Ki-67 的表达显著升高。同时，在 miR-744 表达量相对较高的 DU145 和 PC3
13、细胞中干扰 miR-744 的表达后，通过 MTT 实验和低密度细胞集落形成实验检测发现 miR-744 低表达组中的细胞增殖能力相较 NC 组显著降低。流式细胞仪检测结果表明干扰miR-744 表达后，DU145 和 PC3 细胞凋亡的比例与 NC 组相比明显升高。Transwell 小室实验检测后发现，低表达 miR-744 后，DU145 和 PC3 细胞的侵袭和迁移能力与 NC 组相比受到明显的抑制。裸鼠皮下成瘤实验表明， 干扰miR-744 表达组的细胞瘤体大小和体积明显小于对照组（P0.05） ，同时在皮下移植瘤体的病理切片中，免疫组化实验结果表明细胞增殖相关基因 Ki-67、血管
14、生成影响因子 CD31、CD34 的表达均显著降低，细胞凋亡相关基因 caspase-3的表达明显升高。中文摘要研究结论：以上研究结果表明 miR-744 的高表达能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并抑制细胞凋亡。相反的，干扰 miR-744 表达后，前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显的抑制，细胞的凋亡比例升高。由此可以得出结论，miR-744 在前列腺癌中发挥了促癌基因的作用。关键词：miR-744；细胞增殖；细胞凋亡；Transwell 小室；裸鼠皮下肿瘤。第三部分 miR-744 靶向 NKD1 激活 WNT/-catenin 信号通路研究目的：从第二部分的体内和体外实
15、验结果中我们发现 miR-744 的表达失调可以影响前列腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力，发挥促癌基因的作用。但是 miR-744 发挥作用的机制目前尚未清楚。如上文所述，miRNA 通过碱基互补配对的方式与靶基因 mRNA 的 3UTR 区域结合，降解 mRNA 或抑制 mRNA的翻译。因此，在明确了 miR-744 的生物学特性之后，我们将着重探讨 miR-744 发挥功能作用的分子生物学机制。研究方法：通过昂飞（Affymetrix）人类全基因组表达谱芯片技术结合 miRNA靶基因预测分析软件（miRNADA、TargetScan、RNA22-HSA），我们发现裸角质蛋白同系物 1（
16、NKD1）是 miR-744 在前列腺癌中的潜在靶基因，并且在细胞内采用荧光素酶报告基因实验以及 Western Blot 实验，以及在人前列腺癌和裸鼠皮下瘤体组织的标本内利用 ISH 和 IHC 实验同时验证 miR-744 和 NKD1 之间的表达关系。通过 KEGG 通路分析芯片结果后发现 miR-744 表达失调后，WNT/-catenin 信号通路上的关键负向调控因子 NKD1、GSK3、SFRP1 和TLE3 在 miR-744 失调后均发生显著差异表达，这表明 miR-744 在前列腺癌中可能通过调控 WNT/-catenin 信号通路发挥其促进基因的作用，并且通过TOP/FOP
17、 实验予以验证。最后，我们通过功能学回复实验，在细胞中进一步验证 miR-744 对前列腺癌细胞增殖和侵袭的生物学功能是通过调控 NKD1 来实现的。研究结果：荧光素酶报告基因实验以及 Western Blotting 实验研究结果均表明miR-744 可直接与 NKD1 的 3UTR 区域结合，抑制了 NKD1 蛋白的表达（P0.05） 。ISH 以及 IHC 实验结果发现在人体前列腺癌组织切片中以及裸鼠原东南大学博士学位论文位皮下移植瘤体组织切片中，miR-744 与 NKD1 的表达呈显著负相关。TOP/FOP 实验结果表明 miR-744 的表达失调能够通过调控 NKD1 从而影响WN
18、T/-catenin 信号通路的激活 （P 0.05） 。通过功能学回复实验，我们发现共转染 miR-744 干扰片段和 NKD1 干扰质粒后，细胞的增殖和侵袭能力相比较只干扰了 miR-744 表达的实验组而言显著升高。上述实验更进一步验证了 miR-744 与 NKD1 之间的靶向调控关系。研究结论：NKD1 是 miR-744 的直接靶基因，miR-744 靶向 NKD1 激活了WNT/-catenin 信号通路，并且 miR-744 对前列腺癌生物学功能的影响是通过调控 NKD1 实现的。关键词：荧光素酶报告基因；Western Blotting 实验；人类全基因组表达谱芯片；裸角质蛋
19、白同系物 1（NKD1）；WNT/-catenin 信号通路 。第四部分 NKD1 在前列腺癌中的功能学研究研究目的：在第三部分中，我们已经证实了 miR-744 在前列腺癌中可以直接靶向抑制 NKD1 的表达，并且通过抑制 NKD1 激活了 WNT/-catenin 信号通路，同时也进一步验证了 miR-744 对前列腺癌生物学功能的影响是通过调控 NKD1实现的。并且通过 IHC 实验结果检发现 NKD1 在 CRPC 组织标本中的表达相对于 ADPC 显著降低。 目前关于 NKD1 在前列腺癌细胞中的表达情况以及其发挥的生物学功能还尚未见报道。因此，我们有必要检测 NKD1 在前列腺癌细
20、胞中的表达情况，并且进一步探究在前列腺癌中 NKD1 发挥的生物学功能。研究方法：在前列腺癌细胞系 LNCAP、DU145 和 PC3 中采用 Western Blotting实验检测 NKD1 的差异表达。并且构建 NKD1 的过表达以及干扰质粒，通过MTT 和低密度细胞集落形成实验检测 NKD1 对前列腺癌细胞增殖能力的影响；Transwell 小室实验检测 NKD1 对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。研究结果： qRT-PCR 和 Western Blotting 实验结果表明 DU145 和 PC3 细胞中的 NKD1 表达水平与 LNCAP 细胞相比显著降低（P0.01） 。MTT 实验
21、和低密度细胞集落形成实验结果均表明在 NKD1 表达量相对较高的 LNCAP 细胞中干扰 NKD1 表达后较对照组（NC 组）相比能够显著促进细胞的增殖能力中文摘要（P0.05） 。在 Transwell 小室实验中，干扰 NKD1 表达后能够明显促进 LNCAP细胞的侵袭和迁移能力（P0.05） 。同时，在 NKD1 表达量相对较低的 DU145和 PC3 细胞中过表达 NKD1 后，通过 MTT 实验和低密度细胞集落形成实验检测发现 NKD1 过表达组中的细胞增殖能力相较 NC 组显著降低（P0.05） 。Transwell 小室实验检测后发现，过表达 NKD1 后， DU145 和 PC
22、3 细胞的侵袭能力与 NC 组相比受到明显的抑制（P0.05） 。研究结论：以上研究结果表明 NKD1 在前列腺癌细胞中的表达呈显著差异，并且 NKD1 的表达失调对前列腺癌细胞产生了显著的影响，由此得出，NKD1 在前列腺癌中发挥了抑癌基因的作用。关键词：NKD1；MTT 实验；Transwell 小室；低密度细胞集落形成实验。东南大学博士学位论文The role of miR-744 in prostate cancer and its regulation mechanismsAbstractAs the most common malignancy and the second lea
23、ding cause of cancer-related death among men in developed countries, prostate cancer (PCa) has long been considered as a substantial healthcare challenge in USA. Recent years, with the economy improvement, the morbidity and mortality of PCa has also been steadily increased in China as well. Even tho
24、ugh the majority of PCa patients initially respond well for androgen deprivation therapy, the biggest hindrance for treatment of PCa is that most PCa patients within two years will inevitably progress to the castration-resistant prostate cancer (CRPC), a more aggressive form of PCa and the most comm
25、on cause for prostate cancer patient death. The lacking of effective therapeutics strategies is the major limitation for treatment of recurrent and metastatic PCa. Thus, it is urgent need to understand the molecular mechanisms underlying PCa progression and develop the novel promising therapeutic ap
26、proaches.MicroRNAs (miRNAs) belong to the non-coding RNAs, they regulate gene expression in the posttranscriptional level. Hundreds of miRNAs has yet been discovered. Recent study found that more than 50% of the miRNA genes was in tumor related genomes areas or fragile site, not only played the role
27、 of proto-oncogenes or tumor suppressor genes, but also involved in the development of tumor by fine adjusting several important signaling pathway. Recently, miRNAs control about half of the protein-coding genes, control of apoptosis, cell proliferation, differentiation, metabolism, and individual d
28、evelopment, as well as the occurrence and development of tumor.英文摘要The present study aims to analyse the different expressed miRNA by research of clinical relevance in ADPC and CRPC, and miR-744 is an important miRNA which we interested in. Prostate cancer cell functional experiment was further perf
29、ormed to verify the effect of miR-744 on prostate cancer cells. MiR-744 was a few years later miR-744 has been shown to serve as a tumor suppressor in several cancers including breast cancer, cervical cancer, colon cancer, and hepatocellular carcinoma; on the other hand, miR-744 was highly expressed
30、 in head and neck cancer, pancreatic cancer, and nasopharyngeal carcinoma, and mediated the tumor-promotion effects on these cancers. Using the method of combinating bioinformatics and molecular biology, the molecular mechanism of promoting prostate cancer cell apoptosis by miR-744. Our fndings indi
31、cate that miR-744 acts as one of oncogenic factor in the progression of prostate cancer. Part The differential expression of miR-744 in prostate cancer tissuesObjective: As populations age and progress of the diagnosis, the morbidity and detection retest of ptostate cancer increase in our country. I
32、n the initial stage, many of them are androgen-dependent prostate cancer (ADPC), which will transform into castration-resistant prostate cancer (CRPC), and there are not yet effective treatments currently. Researchs of molecular biology on prostate cancer have become focuses for detection, diagnosis
33、 and treatment to this disease. miRNAs can regulate the expression of genes to control the apoptosis, proliferation, differentiation and metabolism of cells, and the development, progression of tumor through post-transcription. Differential expression of miRNA was detected by miRNA chips in early AD
34、PC and advanced CRPC. Methods: Early ADPC and advanced CRPC were collected from fresh samples according to the instruction of observing of frezon section and preserved in liquid nitrogen. The data were firstly re-analyzed to compare miR-744 expression between metastatic prostate cancer and non-metas
35、tatic prostate cancer obtained from Memorial 东南大学博士学位论文Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) prostate cancer database. Then we analyzed the role of miR-744 in diagnosis of metastasis prostate cancer and the relationship between miR-744 expression and biochemical recurrence.Results: Both three cases
36、from ADPC and CRPC were detected by microRNAs chips. Differential expression of miR-744 in early ADPC and advanced CRPC was detected by qRT-PCR and ISH（P0.001）. Gene chip data about the expression of miRNAs in 98 prostate cancer patients were obtained from Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK
37、CC) prostate cancer database. KaplanMeier analysis with the log-rank test revealed, after radical prostatectomy, that the biochemical relapse-free survival in the patients with low level of miR-744 was significant longer than that in the patients with high level of miR-744 (P 0.0001). Cox regression
38、 analysis to confrm the variables of potential prognostic signifcance and the results suggested that the miR-744 was an independent prognostic factors for biochemical relapse-free survival in patients with PCa.Conclusion: miR-744 expression in CRPC was much higher than in ADPC, which indicated that
39、miR-744 increased along with the progress of prostate cancer, and it may be a potential and important tumor promoter gene.Key words: prostate cancer; ADPC; CRPC; microRNAs chips; miR-744Part Functional analyses of miR-744 in prostate cancerObjective: In part study，we have reported that miR-744 was p
40、robably correlated to the development and progression of prostate cancer, and participated the transformation of prostate cancer cells from androgen dependent to castration resistance. MiR-744 expression in CRPC was much higher than in ADPC and we suggesred that miR-744 was an independent prognostic
41、 factors for biochemical relapse-free survival in patients with PCa. However, the exact biological function of miR-744 on development of human prostate cancer has not been reported. We intend to explore the effects of miR-744 in cell apoptosis, proliferation, migration, invasion 英文摘要and the ability
42、of in vivo tumorigenesis via in vitro cell functional study and subtaneous tumorigenesis in nude mice.Methods: Differential expression of miR-744 in PCa cells was detected by qRT-PCR.The in vitro proliferation of the PCa cells was measured using the MTT assay and Colony formation assay after they we
43、re transformed with miR-744 mimics or anti-miR-744 oligos. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. The ability of PCs cells penetrating transwell was analyzed by transwell migration and invasion experiment. The in vitro effect of miR-744 on the formation of tumor was detected by subcutaneous
44、tumorigenesis in nude mice. Ki-67，Caspase-3 and CD31/34 of implanted tumor were tested by immunohistochemistry to further verify its effect on cell proliferation and tumor microvessel formation.Results: The expression of miR-744 was signifcantly up-regulated in CRPC cell lines (PC3 and DU145) than A
45、DPC cell lines (LNCAP) (P 0.01). MTT assay showed that anti-miR-744 oligos (groups of anti-miR-744) suppressed growth rate in PC3 and DU145 cells while miR-744 minics (groups of miR-744) promoted growth rate in LNCAP cells (P 0.05). Colony formation assay indicated that colony number of PC3 and DU14
46、5 cells transfected with anti-miR-744 oligos was lower than control, in contrast, the number of LNCAP transfected with miR-744 minics was higher than control. Cell apoptosis assay (P 0.05). The consequence showed PC3 and DU145 cells with anti-miR-744 oligos demonstrate a higher apoptosis than contro
47、l, on the contrary, the apoptosis in LNCAP cells transfected with miR-744 minics was lower than control (P 0.05). The results of Transwell assay showed that migration and invasion ability of anti-miR-744 oligos group was lower than negative control in PC3 and DU145 cells, while cells with upregulate
48、d expression of mir-744 present a higher migration and invasion ability than control in LNCAP (P 0.05). Subcutaneous tumors formed in nude mice by PC3 cells stably inhibition of miR744 or control (P 0.05). Silencing miR-744 by its inhibitor obviously suppressed tumor growth as manifested by reduced
49、tumor size and tumor weight. In contrast, when endogenous miR-744 was stably overexpressed using LV-miR744 that encodes miR- 744 mimic by infected LNCaP cells, the tumors were larger in size and had increased weight than 东南大学博士学位论文those formed by corresponding negative control cells subcutaneous tumors formed in nude mice by LNCaP cells stably overexpression of miR-744 or control (P 0.05). Immunohistochemical staining revealed that reduced Ki67-positive cells, CD31-positive cells and CD34-positive cells, and signifcantly increased caspase-3-positive cells in miR-744 inhibitor
