柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定.docx

1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题 目：柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 班 级： 食安 指导教师： 职 称： 二 O 一七 年 五 月目录摘 要 IAbstract II1 绪论 12 抗氧化性的测定 22.1 材料和方法 .22.1.1 试剂 22.1.2 仪器 22.1.3 实验方法 22.2 实验结果 .52.2.1 清除羟基自由基 52.2.2 清除超氧阴离子自由基 52.2.3 清除 DPPH 自由基 .62.2.4 还原力测定 72.3 实验小结 .8参考文献 9致谢

2、11柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定I摘 要抗氧化剂能够清除人体内的自由基而具有延缓衰老、预防疾病的作用。因此，筛选高效、稳定、低毒的抗氧化剂具有极其重要的意义。本试验选用柠檬酸钠修饰的纳米硒（CitSeNPs ）为研究对象，利用邻苯三酚自氧化法、清除羟基自由基法、DPPH 自由基法、总还原力法测定 CitSeNPs 溶胶的抗氧化性。结果显示CitSeNPs 具有很强的清除自由基的能力，其清除能力与浓度呈正相关。其中，CitSeNPs 清除羟基自由基的能力明显大于抗坏血酸；当浓度大于 0.4 mg/mL 时，CitSeNPs 清除超氧阴离子自由基的能力强于抗坏血酸。说明 CitSeNPs 有

3、望成为一种高活性的纳米材料类抗氧化剂。关键词 ： 纳米硒；柠檬酸钠；抗坏血酸；抗氧化性柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定IIAbstractAntioxidants can remove free radicals in the human body and have the effect of deferring organism aging and preventing diseases. Therefore, screening efficient, stable, and low toxicity antioxidants has an extremely important sign

4、ificance. In this study, sodium citrate which modified nano-selenium was used as the object of study. The pyreparens self-oxidation method, the hydroxyl radical scavenging method, the DPPH radical method and the total reducing force method were used to determine the antioxidant activity. The results

5、 showed that Cit SeNPs had a strong ability to scavenge free radicals, and their scavenging ability was positively correlated with the liquid concentration. The ability of Cit SeNPs to scavenge hydroxyl radicals was significantly higher than that of ascorbic acid. When the concentration was over 0.4

6、 mg/mL, Cit SeNPs has a stronger ability of scavenging superoxide anion radicals than ascorbic acid. All of these results prove that Cit SeNPs is expected to be a kind of highly active antioxidant of nanometers material.Key words : nano-selenium ; sodium citrate ; ascorbic acid ; oxidative stability

7、柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定11 绪论人体在日常代谢过程中会不断产生自由基，包括羟基自由基(OH)、过氧化自由基和超氧阴离子自由基(O 2-)等 1。这些自由基会造成氧化性的损伤，破坏人体各个器官的正常功能。通过维持各游离自由基在体内的平衡，能有效预防机体细胞免疫力下降、细胞衰老、心血管病变、细胞癌变等众多疾病 2。因此，适量摄入一些具有抗氧化活性的保健品和药品有利于增强机体的抗氧化能力 3-4 。当今市面上常见的抗氧化剂有:丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚（TBHQ）等。但是，这些抗氧化剂热稳定性差、抗氧化效率较低、有效浓度范围比较狭窄，寻找一种高效低毒

8、的抗氧化剂成为目前亟待解决的问题。硒是人体必不可少的微量元素，与人体内多种酶的作用密切相关，在生命过程中起着极其重要的作用。硒制品（如硒旺胶囊）在保健食品和医药品中占有重要的地位。夏弈明教授在 2009 年的中国硒资源开发与利用研讨会（恩施）上指出：目前硒的摄入量标准是根据满足谷胱甘肽过氧化物酶的活性而制定的，要想真正满足对硒的活性需求，人体还是要靠硒营养品的摄入。然而，作为国际四大抗氧化剂的硒抗氧化效果强，但营养剂量和毒性之间范围比较窄。纳米硒的出现，解决了硒元素的这一应用难题。纳米硒既没有破坏硒元素在人体内的活性，又确保了硒的高安全性。硒旺胶囊的问世，实现了纳米硒在人体当中的应用。为了筛选

9、出具有抗氧化活性的纳米硒，进一步实现纳米硒作为抗氧化剂的应用，本实验选用以柠檬酸钠修饰的 CitSeNPs 溶胶作为研究对象 5-6，通过清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基的能力、还原力测定这四种方法来评价其抗氧化能力。柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定22 抗氧化性的测定2.1 材料和方法2.1.1 试剂2.1.2 仪器仪器 生产厂家FA2104 型电子天平 奥豪斯国际贸易（上海）有限公司分光光度计 上海元析仪器有限公司JW-1042 低速离心机 上海安亭科学仪器厂超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司数显恒温搅拌循环水箱 常州国华电器有限公司2.1.3 实验方法（1）羟

10、基自由基清除能力的测定柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定31）原理：Fe 2+与 H2O2 反应生成羟基自由基（OH） ，由于OH 化学性质很活跃，存在的时间短，水杨酸可作为OH 捕捉剂，水杨酸与被捕获的羟基自由基反应生成两种有色的物质。通过测定这两种羟基化合物在 510 nm 处的吸光度，可以间接得出样品清除羟基自由基能力的强弱 7-9。2）方法：借鉴 Zhong 等人的方法 10。测定前用蒸馏水将放置在冰箱中保存的 3 mg/mL 的 CitSeNPs 溶液稀释成不同浓度:分别为 0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL。

11、各取 1.0 mL 上述配好的样液于 5 支试管中，按照先后顺序加入 6 mmol/L 的 FeSO4 1.0 mL、 6 mmol/L 的 H2O2 1.0 mL，混匀后静放 10 min。再加入 6 mmol/L 的水杨酸溶液 1.0 mL，混匀后静置 30 min，最后在 510 nm 处测其吸光度值 Ai。其他处理一样的情况下，把 1.0 mL 的水杨酸换成蒸馏水，测得吸光度 Aj；把 1.0 mL 的 CitSeNPs 溶液换成蒸馏水，测得吸光度 A0。以维生素 C 和柠檬酸钠作为阳性对照。把各组重复三次的吸光度值取平均值计算清除率： E=（A 0-Ai+Aj）/A 0样品浓度为横坐

12、标，羟自由基清除率为纵坐标，运用办公软件 Excel 2010 作出平均值标准差的曲线并对曲线进行分析。（2） 超氧阴离子清除能力的测定 1）原理：在溶液呈碱性的环境下，邻苯三酚会发生氧化成半醌自由基，然后半醌自由基再氧化成醌的反应，这两步反应都会生成超氧自由基 11。溶液呈弱碱性时，邻苯三酚自氧化速率随着 O2-浓度的增大而增大，因此通过测定波长为 420 nm 处溶液的吸光度值可间接得出超氧阴离子（O 2-）的清除量 12。2）方法：借鉴 Zhang 等人的方法 13。将 CitSeNPs 溶液稀释成和实验（1）相同浓度的样液。在 5 支试管中各加入 2.25 mL 的 Tris-HCl（

13、50 mmol/L pH=8.2）溶液，加入 1 mL 的蒸馏水后在 25 oC 下水浴 20 min，20 min 后先往试管中加入 1mL 上述配好的待测 CitSeNPs 溶液，再加入浓度为 25 mmoL 的邻苯三酚溶液 0.25 mL，充分摇匀后放在 25 oC 的水浴箱中反应 6 min，将其取出后加入 0.5 mL 10 mmol/L 的HCl。最后于 320 nm 下测吸光度值 Ai。其他处理不变的情况下，0.5 mL 的邻苯三酚换成蒸馏水，测吸光度 Aj；1.0 mL 的 CitSeNPs 溶液换成蒸馏水，测吸光度 A0，以维生素 C 和柠檬酸钠作为阳性对照。各组重复三次取平

14、均值。超氧阴离子自由基（O 2-）的清除率： S=（A 0-Ai+Aj）/A 0柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定4样品浓度为横坐标，超氧阴离子自由基清除率为纵坐标，运用办公软件 Excel 2010 作出平均值标准差的曲线并对曲线进行分析。（3） DPPH 自由基清除能力的测定 1）原理：DPPH 自由基是一种稳定的含氮自由基，其醇溶液显紫色，在 517 nm处有最大吸收峰。当加入抗氧化剂时，N 上的单电子与其配对，溶液的颜色就会变浅。在 517 nm 处的吸光度就会呈一定的线性关系下降。抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化性越强。2）方法：借鉴南等人的方法 14。测定前将放置在冰箱

15、中保存的 3 mg/mL 的CitSeNPs 溶液取出，用蒸馏水将其稀释成不同浓度:分别为 0.00125 mg/mL、0.0025 mg/mL、 0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL。取 1.0 mL 上述已配好的不同浓度的 CitSeNPs 溶液于洁净干燥的试管中，加入 1.0 mL 0.1 mmol/L的 DPPH 溶液，充分摇匀后避光反应 20 min，于 517 nm 处测吸光度 Ai，把 1.0 mL的 DPPH 换成无水乙醇，其他处理一样的情况下测吸光度值 Aj；把 1.0 mL 的CitSeNPs 溶液换成蒸馏水，其他处理不变的条件下测吸光度值 A

16、0。以维生素 C 和柠檬酸钠作为阳性对照。各组重复三次取平均值计算清除率：I =（A 0-Ai+Aj）/ A 0样品浓度为横坐标，DPPH 自由基清除率为纵坐标，作出平均值 标准差的曲线并对曲线进行分析。（4） 还原力的测定 1）原理：待测样品的抗氧化性将 K3Fe(CN)6 还原 K4Fe(CN)6，K 4Fe(CN)6 再和FeCl3 反应，生成在 700 nm 处有最大吸收峰的普鲁士蓝(Fe 4Fe(CN)63)。一般来说，溶液的吸光度越大，表明还原能力也越强，因此可以通过反应后的溶液在 700 nm 处吸光度值的大小来间接得出该抗氧化剂还原力的大小。2）方法：借鉴顾彩琴等人的方法 15

17、-16。测定前将放在冰箱中保存的 3 mg/mL的 CitSeNPs 溶液取出， 稀释成和实验（1）相同浓度的样液。准确移取 1.0 mL 上述已配好的不同浓度的 CitSeNPs 溶液于洁净干燥的试管中，加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.25 mL (pH=6.6)和 1%的铁氰化钾溶液 1.25 mL，充分摇匀后放置在温度为 50 oC 的恒温水浴箱中保温 20min，接着取出用流动的自来水使其快速冷却，加入 1.0 mL 10%的三氯乙酸， 3000 r/min 的转速离心 10 min，取 0.5 mL 上清液，加入 0.1%的三氯化铁溶液 0.25 mL，再移取 1.75

18、mL 的蒸馏水，充分混匀后在吸光度为 700 nm 处测定其吸光度 A。以维生素 C 和柠檬酸钠作为对照，各组均按上述方法重复测量三柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定5次，记录吸光度值为 A。作出。最后运用办公软件 Excel 2010 画出吸光度与浓度之间的关系曲线，结果用平均值标准差表示，并对曲线进行分析。2.2 实验结果2.2.1 清除羟基自由基维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对超氧阴离子自由基清除效果如图 1 所示。结果显示，三者的清除率均随样液浓度的增大而增大。特别的是 CitSeNPs 的清除效果明显高于其他两者，当浓度达到 0.4 mg/mL 时，CitSeNPs 的清

19、除率可达到 96.85%，而维生素 C 和柠檬酸钠分别为 78.45%和 61.18%。说明 CitSeNPs 清除羟基自由基的能力强于维生素 C 和修饰剂柠檬酸钠。0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.450102030405060708090100110维 生 素C柠 檬 酸 钠CitSeNPs浓度（mg/mL ）清除率（% ）图 1 维生素 C、柠檬酸钠、CitSeNPs 对羟自由基的清除率比较2.2.2 清除超氧阴离子自由基维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对超氧阴离子自由基清除效果如图 2 所示。结果显示，维生素 C 和 CitSeN

20、Ps 对自由基的清除率与浓度呈正相关，柠檬酸钠清除柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定6自由基的能力几乎不随浓度的变化而变化。此外，当浓度大于 0.4 mg/mL 时，CitSeNPs 对超氧阴离子的清除率的能力与维生素 C 基本相同，分别为 97.49%和97.27%，而柠檬酸钠的清除率基本都保持在 4%左右。0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.450102030405060708090100110维 生 素C柠 檬 酸 钠CitSeNPs浓 度 （mg/mL）清除率（% ）图 2 维生素 C、柠檬酸钠、CitSeNPs 对超氧阴离子自由基清除率比较

21、2.2.3 清除 DPPH 自由基维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对 DPPH 自由基的清除效果如图 3 所示。结果显示，维生素 C 和 CitSeNPs 对自由基的清除率与浓度呈正相关，且在样液的浓度很低时就体现出较好的清除能力，而柠檬酸钠基本没有清除 DPPH 自由基的能力。当溶液浓度为 0.02 mg/mL 时，CitSeNPs 对 DPPH 自由基的清除率为 74.03%，维生素C 为 93.56%。柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定70 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.450102030405060708090100110维 生

22、素C柠 檬 酸 钠CitSeNPs浓 度 （mg/mL）清 除 率 （% ）图 3 维生素 C、柠檬酸钠、CitSeNPs 对 DPPH 自由基清除率比较2.2.4 还原力测定维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 的总还原力如图 4 所示。结果显示，维生素C 和 CitSeNPs 的还原力随浓度的增大而增大,而柠檬酸钠的还原力与浓度无关，且还原力基本接近于 0。柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定80 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025-20020406080100120维 生 素C柠 檬 酸 钠CitSeNPs浓 度 （mg/mL）清 除 率 （%）图 4 维生素 C、

23、柠檬酸钠、CitSeNPs 的还原力大小比较2.3 实验小结通过清除羟基自由基、超氧阴离子自由基 DPPH 自由基和还原力的测定得知：在实验浓度范围内,CitSeNPs 清除羟基自由基的能力要强于维生素 C 和柠檬酸钠，且在浓度很低时，清除效果就很明显，体现了 CitSeNPs 清除自由基的高效性。柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定9参考文献1 Valko M, Leibfritz D, Moncol J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease J. T

24、he International Journal of Biochemistry &Cell Biology, 2007, 39(1) : 44-84. 2 Mayne S. T. Antioxidant nutrients and chronic disease use of biomarkers of exposure and oxidative stress status in epidemiologic research J. Journal of Nutrition, 2003, 133(3) : 933-940.3 黄纪念. 迷迭香抗氧化活性及其作用机理研究和天然抗氧化保健品的研制

25、D. 中国农业大学, 2003.4 赵鑫. 黑木耳分级多糖抗氧化活性及其相关生理功能研究D. 东北林业大学, 2011.5 白燕，李维嘉，吴雅琴，等. 液相中蔗糖对硒纳米组装的调控与稳定作研究J. 高等学校化学学报，2007, 28(1): 153-155.6 Bai, Y., Wang, Y. D., Zhou, Y. H., et al. Modification and modulation of saccharides on elemental selenium nanoparticles in liquid phaseJ . Materials Letters, 2008, 62(1

26、5): 2311-2314.7 冯慧萍，李亦聪. 羟自由基与水杨酸反应机理的初探 J. 光谱实验室，2009, 26(4): 931-938. 8 管荷兰，王永顺. 水杨酸在羟基自由基检测中的应用R. 理化检测-化学分册，2010,46(3): 333-335. 9 贾之慎，邬建敏，唐孟成. 比色法测定 Fenton 反应产生的羟自由基 J. 生物化学与生物物理进展 1996, 23(2) :184-186. 10 Zhong, X. K., Jin, X., Lai, F. Y., et al. Chemical analysis and antioxidant activities in

27、vitro of polysaccharide extracted from Opuntia ficus indica Mill. Cultivated in ChinaJ. Carbohydrate Polymers, 2010, 82(3): 722-727. 11 邹洪，袁倬斌. 邻苯三酚自氧化的电化学研究J. 分析实验室， 1997, 16(1): 36-38. 12 陈玫，张海德，陈敏，等. 几种中药不同溶剂组分的抗氧化活性研究J. 中山大学学报:自然科学版, 2006, 45(6): 1329-1331.13 Zhang, D. H., Wu, H. X., Xia, Z. M.,

28、 et al. Partial characterization, antioxidant and antitumor activities of three sulfated polysaccharides purified from Bullacta exarataJ. Journal of Functional Foods, 2012, 4(4), 784-792.14 南海娟，莫海珍，颜振敏，等. 槲树叶黄酮的抗氧化特性研究 J. 中国食品添加剂，2013, 02: 83-87.15 顾采琴，张织芬，朱冬雪，等. 香蕉果皮黄酮抗氧化活性研究 J. 广州大学学报(自然科学版)，柠檬酸钠修

29、饰的纳米硒抗氧化活性测定102013, 03: 12-16.16 YEN, G. C., DUH, P. D., TSAI, H. L. Antioxidant and pro-oxidant properties of ascorbic acid and gallie acidJ. Food Chemistry, 2002, 79(3): 307-313.柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定11致谢感觉昨天才步入大学，今天就要离开学校了。大学四年给我留下了许多美好的回忆，论文完成过程的酸甜苦辣更让我的回忆有了不一样的味道。虽然论文的完成过程中遇到了很多的挫折，但老师的悉心教导和褚路路师兄的耐心指导让我的论文在今天画上了一个圆满的句号。另外非常感谢江西农业大学和食品科学与工程学院，是学校和学院为我们提供了浓厚的学习氛围和优美的生活环境。还要感谢学院所有默默付出的老师，你们不仅让我学到了许多的专业知识，更使我们明白了许多待人接物与为人处世的道理。再次感谢师兄带我熟悉实验室的情况和仪器设备的使用，在我实验一筹莫展时的开导和帮助，他在学业上兢兢业业和努力刻苦的精神时刻感染和鼓励着我。郑重感谢我的导师在实验期间经常加班为我解答问题，在论文书写过程中不厌其烦一遍遍地为我审批论文。最后感谢各位答辩老师审阅我的论文，感谢老师在百忙之中对我论文存在的问题提出改进的建议。