1、南京大学本科生毕业论文本 科 毕 业 设 计院 系 生 命 科 学 学 院 专 业 生 物 科 学 类 题 目 利用靶向中枢神经系统的外泌囊泡戒除阿 片 片类精神依赖性药物的研究 年 级 学 号 学生姓名 指导老师 职 称 论文提交日期 南京大学本科生毕业论文南京大学本科生毕业论文（设计、作品）中文摘要题目： 利用靶向中枢神经系统的外泌囊泡戒除阿片类精神依赖性药 物的研究 生命科学学院 院系生物科学类专业 级本科生姓名： 指导教师（姓名、职称）： 摘要：细胞分泌的为囊泡已经被证明是一种是细胞之间传递小 RNA 的有效载体，也是一种被广泛认可的用于基因治疗的传输工具。在此次研究中，我们使用改造过
2、的在膜表面表达了狂犬病毒糖蛋肽（RVG）短肽的外泌小体向中枢神经系统中输送阿片类受体 （MOR）的 siRNA，用以治疗阿片类精神性药物的上瘾。我们发现 受体的 siRNA 可以成功的包裹进外泌小体中。这些外泌小体也能够成功地将 受体的 siRNA 输送到神经元细胞 Neuro2A 和小鼠的脑组织中。从功能上看，装载了 siRNA 的 RVG 外泌小体可以特异性地下调 受体的 mRNA 和蛋白表达水平。令人惊讶的是，传送进中枢神经系统的 受体的 siRNA 通过下调 受体的蛋白水平，可以有效地抑制吗啡上瘾。我们证明，经过整合 RVG 短肽的经过改造的外泌小体可以有效地将 siRNA 递送到中枢
3、神经系统中，并通过下调 受体的表达水平治疗阿片类药物上瘾。我们的研究提供了治疗药物上瘾和治疗中枢神经系统疾病的一种新的思路。关键词：外泌囊泡、 阿片类受体、小干扰核糖核酸、核糖核酸干扰南京大学本科生毕业论文南京大学本科生毕业论文（设计、作品）英文摘要THESIS：Targeted Exosome-mediated Delivery of Opioid Receptor Mu siRNA for the Treatment of Morphine Relapse DEPARTMENT： SPECIALIZATION: BiologyUNDERGRADUATE: MENTOR: ABSTRACT：
4、Cell-derived microvesicles (MVs) have been demonstrated to be efficient carriers of small RNAs to neighbouring or distant cells, highlighting the preponderance of MVs as carriers for gene therapy over other artificial delivery tools. In the present study, we employed modified exosomes expressing the
5、 neuron-specific rabies viral glycoprotein (RVG) peptide on the membrane surface to deliver opioid receptor mu (MOR) siRNA into the brain to treat morphine addiction. We found that MOR siRNA could be efficiently packaged into RVG exosomes and was associated with argonaute 2 (AGO2) in exosomes. These
6、 exosomes efficiently and specifically delivered MOR siRNA into Neuro2A cells and the mouse brain. Functionally, siRNA-loaded RVG exosomes significantly reduced MOR mRNA and protein levels. Surprisingly, MOR siRNA delivered by the RVG exosomes strongly inhibited morphine relapse via the down-regulat
7、ion of MOR expression levels. In conclusion, our results demonstrate that targeted RVG exosomes can efficiently transfer siRNA to the central nervous system and mediate the treatment of morphine relapse by down-regulating MOR expression levels. Our study provides a brand new strategy to treat drug r
8、elapse and diseases of the central nervous system.KEY WORDS: exosome, opiate receptor, siRNA, RNAi南京大学本科生毕业论文目录第一章 研究背景综述 11.1 毒品背景概述 .11.2 RNAi 背景介绍 41.2.1 miRNA 内容概述 41.2.2 RNAi 内容概述 .71.3 exosome 背景介绍 .81.3.1 exosome 的分类与性质 81.3.2 exosome 与 RNA 的相互作用 101.3.3 exosome 摄入 RNA 的机理 111.3.4 exosome 的靶向
9、性改造 11第二章 实验部分 132.1 exosome 包裹 siRNA 效率测试 132.1.1 实验材料： 132.1.2 实验方法： 132.1.3 实验结果： 142.1.4 分析： 142.2 exosome 靶向性实验 .142.2.1 exosome 体外靶向性实验 152.2.2 exosome 体内靶向性实验 202.3 exosome 功能性研究 .252.3.1 exosome 体外功能性研究 252.3.2 exosome 体内功能性研究 272.4 实验讨论 .31参考文献 I本科期间发表的成果 .VI致谢 VII附录 .VIII南京大学本科生毕业论文1第一章 研究
10、背景综述1.1 毒品背景概述毒品问题一直是全世界人类面临的重大问题。毒品问题既是犯罪问题，也是经济问题和科学问题。日趋严重的毒品问题已经成为全球性的灾难。目前全世界每年的毒品交易额高达 5000 亿美元以上，全世界吸食各种毒品的人数高达 2.42 亿人，其中 17-35 周岁的青壮年占 78%1。毒品的种类有很多。从毒品的来源来看，可以分为天然毒品，合成和半合成毒品。毒品是指鸦片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒） 、吗啡、大麻、可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品。其中最常见的是麻醉药品类中的大麻类、鸦片类和可卡因类2。目前对人类社会危害最大的是鸦片类毒品，尤其是海洛因和
11、吗啡。海洛因（Heroin）化学名 “二乙酰吗啡” ，俗称白粉或者白面。海洛因镇痛效果是吗啡的 4-8 倍，医学上曾广泛用于麻醉镇痛，但成瘾快，极难戒断。长期使用会破坏人的免疫功能，并导致心、肝、肾等主要脏器损伤。历史上海洛因也曾被用做精神药品戒断吗啡，但由于副作用过大，最终被定为毒品。吗啡是罂粟提取物中具有药理活性的主要生物碱，是一种历史悠久，疗效卓著的镇痛药物，其使用时间已达 4000 年以上。但由于吗啡可致快感而且极其容易依赖成瘾，并且由于吗啡及其化学合成衍生物海洛因的滥用，吗啡成瘾性已经成为全球关注的医学和社会问题。吗啡使用达到一定剂量时可以使机体成瘾。成瘾性又称精神依赖性，是一种反映
12、心理异常的行为表现，其特点是纯粹以追求精神享受为用药目的，不择手段和不由自主地渴望得到药物；用药后可以获得一种特殊的心满意足的“快感” ，从而根深蒂固地在心理上形成了对阿片类镇痛药的依赖，用药目的与疼痛治疗无关。有关阿片类毒品戒断综合征机理的研究，虽有进展，但目前仍尚未完全明南京大学本科生毕业论文2了。阿片类药物可引起细胞信使传导系统的改变，包括阿片受体脱敏和下调及与 G 蛋白偶联、不同亚基 G 蛋白的上调或下调、腺苷酸环化酶活性的变化、转录因子的激活等，尤其是兴奋性氨基酸（EEA） 、N- 甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体、Ca 2+、一氧化氮（ NO）和环鸟苷酸（ cGMP） ，在吗啡依
13、赖形成及产生戒断综合征中起十分重要的作用3。阿片类受体是介导内源性阿片肽及阿片类镇痛药物发挥作用的受体。目前已知有 5 种阿片类受体，编号分别为 、。在脑中至少存在、 3 种阿片受体参与阿片类药物的依赖成瘾。对于成瘾性， 受体起主要作用， 和 受体与成瘾性有关。吗啡引起神经兴奋的机理正常情况下，阿片受体以及阿片肽系统通过各种复杂的神经体液机制调节着体内众多的神经递质、调质以及内分泌的作用，保持着体内各系统之间的功能平衡。有研究表明，外源性阿片刺激 受体转化为结构活化状态。在经过阿片类药物处理后，活化 受体上调及 cAMP 系统上调，可增加腺苷酸环化酶（AC）和蛋白激酶 A（PKA）活性。停用阿
14、片类药物后，导致一个自发的 cAMP 迅速而大幅度增高的调节过程。因此，在外源性阿片类药物进入机体，作用于阿片类南京大学本科生毕业论文3受体及阿片肽系统引起一系列适应性变化，以建立新的平衡机制。阿片受体是 G 蛋白偶联受体，可以通过多种第二信使介导神经性蛋白质磷酸化，结果产生一系列神经生理功能依赖成瘾的变化。G 蛋白和 cAMP 系统的变化部分体现于其基于的表达水平，阿片类药物的急性作用可使蓝斑神经元中的 c-los 基因表达水平下降，c-los 及其相关基因转录因子水平降低在吗啡依赖性变化中起重要作用。若长期作用保持在该水平，使用纳曲酮激发戒断症状时，c-los 和 c-jun 基因表达水平
15、数倍增大。阿片类药物通过抑制电压敏感性 Ca2+通道，阻止 Ca2+内流，从而使神经元细胞内 Ca2+含量下降，并维持低水平，从而抑制神经元细胞放电，机体则表现为出现耐药。一旦突然停止给药或应用拮抗剂则迅速提高细胞内 Ca2+水平，从而出现高度兴奋，增加了神经递质的释放，出现了戒断综合征。南京大学本科生毕业论文41.2 RNAi 背景介绍1.2.1 miRNA 内容概述1.2.1.1 miRNA 的发现过程1993 年 Lee 等人在对秀丽线虫（Celegans ）的突变体进行遗传分析时，发现了第一个 miRNA 基因lin4，这一基因虽然不编码任何蛋白，却可以通过产生一对小 RNA 调控线虫
16、幼虫的发育。一个 RNA 大约 22 个 nt，另一个大约66 个 nt。较长的一个 nt 被认为是可以折叠成发夹结构，并且认为是较短的那个RNA 的前体。他把长度约为 22 个 nt 的 RNA，叫 lin-4 RNA。lin-4 RNA 会使lin-14 基因沉默，其功能是使发育事件延迟，因此 lin-4 基因的突变会使线虫中许多应该在早期出现的发育事件延迟发生4。并且，lin-4 基因活性水平的降低仅 d 导致蛋白水平降低，其转录水平没有变化4。这种现象表明可能存在一种特殊的调控机制影响了 lin-4 mRNA 的活性。后来证明，这种负调控机制正是由lin-4 编码的小 RNA 片段执行
17、的，这段长度仅仅 21 nt 的 RNA 通过与 lin-4 mRNA 的 3-untranslated region（3-UTR）的不完全互补，影响 lin-4 mRNA 的翻译，当时的研究者称之为小分子时序 RNA（small temporal RNA，stRNA）5-7。miRNA 前体及成熟体示意图随后的几年时间里科学家对 miRNA 的研究不断加深，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在人类、小鼠、大鼠、果蝇、斑马鱼、拟南芥等生物物种发现了成千种 miRNAs。被鉴定的 miRNAs 均被 miRBase 网站整理并加以注释8-10。此网站由著名的 Sanger 研究所主
18、办，并对公众开放。（http:/microrna.sanger.ac.uk/） 。到 2011 年 11 月， miRBase 数据库已更新到南京大学本科生毕业论文518.0 版本,共发布 168 个物种的 18226 种发夹前体 miRNA，表达 21643 种成熟miRNA。microRNA 参与生命过程中一系列的重要过程，包括早期的胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化等等，在生命过程中起着非常重要的作用。1.2.1.2 miRNA 的成熟过程经过数十年的研究，人们对 microRNA 在体内的成熟过程已经十分了解7-11。(1) 首先，miRNA 由 RNA 聚合酶（Pol
19、II）转录生成一个大小约为 1000bp的长链 RNA 转录产物，即 pri-miRNA（primary miRNA） 。(2) 然后，在细胞核中，内切核酸酶 RNase型蛋白 Drosha 在 pri-miRNA 分子基部切割双链形成 60-100bp 的 5末端具有磷酸基、3末端具有二核苷酸突出（over-hang ）的茎环中间体，即 miRNA 的前体分子（precursor miRNA，pre-miRNA） 。(3) 然后，转运蛋白 Exportin-5 通过识别 pre-miRNA 的 3端的二核苷酸突出信号而与 pre-miRNA 结合，依赖 Ran-GTP 将 pre-miRNA
20、 输出到细胞质。植物中是由 Exportin-5 的同源物 HASTY 负责 miRNA 前体的输出。(4) 之后，另一个内切核酸酶 RNase型蛋白 Dicer 识别 pre-miRNA 双链的5末端磷酸及 3末端突出，在距茎环大约两个螺旋转角处切断螺旋体的双链，产生一个结构类似于 siRNA 的长为 19-23 个核苷酸的小分子双链 RNA（miRNA:miRNA* duplex） ，其中成熟的 miRNA 来自于 pre-miRNA 的一条臂，pre-miRNA 的另外一条臂产生一个长度与 miRNA 相同的片段，即 miRNA*。(5) 最后，RNA 解旋酶作用于 miRNA:miRN
21、A* duplex，经历一个链选择过程，双链 RNA 的一条链 miRNA*被降解，另一条成为成熟的 miRNA，进入 RNA 诱导的沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex，RISC ）中发挥作用。南京大学本科生毕业论文6miRNA 的加工成熟过程1.2.1.3 miRNA 的作用机制miRNA 与 RISC 结合后形成 miRNA 偶联 RISC 沉默复合体。miRNA 偶联RISC 沉默复合体发挥生理作用有两种方式。当 miRNA 和靶基因的 mRNA 完全互补时，RISC 会切割靶基因 mRNA，从而使 mRNA 完全失去活性；当 miRNA与靶基因 mR
22、NA 不完全互补时，RISC 不会切割靶基因的 mRNA，而是通过占位效应阻止核糖体正常翻译 mRNA，从而抑制靶基因的正常表达 12-14。南京大学本科生毕业论文7miRNA 指导的对 mRNA 的切割或翻译抑制1.2.2 RNAi 内容概述1.2.2.1 RNAi 的发现1990年，Jorgensen等将紫色素合成基因导入牵牛花中,发现不但导入的基因没有表达,植物本身的色素合成基 因也受到某种程度的抑制,这种现象被称为共抑制15。随后又有实验发现将 albino-3基因导入链孢霉中,其内源性基因表达减弱。1995 年, Guo等在利用反义RNA阻断线虫par-1基因表达时,发现反义和正义R
23、NA 均能抑制该基因的表达,这在当时无法解释16。1998年, Fire 证实上述现象是由于 ssRNA中混有 dsRNA而导致的,纯化的dsRNA 可以产生比ssRNA 强约两个数量级的抑制效果17。同年，dsRNA介导的基因表达阻抑在锥虫和果蝇南京大学本科生毕业论文8中得到证实。这种生物界内广泛存在的由dsRNA介导的同源基因表达抑制现象成为RNAi，人工合成的dsRNA称为siRNA 。1.2.2.2 哺乳动物中 RNAi 的作用机理哺乳动物中利用 siRNA 引发 RNAi 并降解 mRNA 的机理与 miRNA 抑制mRNA 的机理类似，所涉及到的许多蛋白也相同。Hannon 等发现
24、 Dicer 会将双链 RNA 加工成 21-23 对核苷酸的 siRNA18。Gregory 和 Matranga 等发现 Ago2 蛋白降解双链 siRNA 中的一条链，另一条链进入 RISC 复合体19。Jayasena 等分析了 siRNA 两段的热动力学稳定性，结果表明有效的 siRNA，其反义链 5端的热动力学稳定性比正义链 5端的差，这样的差别可能决定了 siRNA 中哪一条链进入 RISC 复合体。进入 RISC 复合体的 siRNA 单链具有了 RNAi 的活性。如果靶基因的mRNA 能与 siRNA 完全配对，或者部分配对，那么靶基因的 mRNA 将会被切割。靶基因 mRN
25、A 由 siRNA 介导的切割出的 5端产物和 3端产物会通过不同的途径被降解：5端的产物有外切酶体重大 3-5核酸外切酶降解；3端产物则由 P body 中的 Xrn-1 降解20-23。1.2.2.3 siRNA 的获得目前共有 5 种方法可以用于 siRNA 的制备，分别为：化学合成法、体外转录法、长链 dsRNA 的 RNase III 体外消化法、siRNA 表达载体法和 siRNA 表达框架法。前 3 种是在体外制备然后转入细胞中；后两种则是基于具有合适启动子的载体或转录原件在哺乳动物或细胞中转录生成 siRNA。1.3 exosome 背景介绍1.3.1 exosome 的分类与
26、性质细胞间运输载体（extracellular vesicles, EVs） ，在细胞间的物质交换和信息南京大学本科生毕业论文9交流中具有极其重要的作用。细胞间运输载体有许多分类，包括外泌小体（exosome） ，微囊泡（Microvesicle）和凋亡小体（apoptotic bodies） 。外泌小体（exosome）是一种纳米载体，直径大约 40-100 纳米左右。腔内小体（intraluminal vesicles， ILVs）在内质网中形成，并被包裹在多泡小体（multivesicular bodies, MVBs）中。当多泡小体和细胞膜融合时，外泌小体从细胞内被分泌到细胞外。微囊泡
27、（Microvesicle ，也被称为 ectosomes，或者 shedding vesicles）比外泌小体稍大，直径约 100nm-1um。微囊泡通过出泡的方式从细胞膜上脱离下来，形成微囊泡。凋亡小体（apoptotic bodies）的直径大约 0.5-2um，通过从凋亡细胞上脱落的方式形成24,25 。外泌小体是被研究的最为透彻的细胞间运输载体。许多种类的细胞都可以分泌外泌小体，包括干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经元细胞和肿瘤细胞等。外泌小体也在绝大多数体液中可以被检测到，包括血液、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊液和腹水等26,27。哺乳动物细胞分泌的 exosome 的主要成分为脂
28、质、蛋白质和 RNA。Exosome 所含有的脂质的主要种类有鞘磷脂（sphingomyelin） 、胆固醇（cholesterol ） 、鞘糖脂（ glycosphingolipid）、神经酰胺（ceramide）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine ）、溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholine）、溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-phosphatidylethanolamine），以及含有短链饱和脂肪酸（14：0、16：0）的卵磷脂28-31。Exosome 所含有的蛋白质中有很多种类被公认为 exosome 的标志蛋白（markers） 。 Exosom
29、e 的标志蛋白主要包括：内体蛋白分选转运装置（Endosomal Sorting Complex Required for Transport, ESCRT）的组成蛋白，比如 Alix、TSG101；热激蛋白（heat-shock protein） ，比如 HSP 90/7032。还有一种名为 tetraspanins 的跨膜蛋白也是 exosome 的标志蛋白33。Tetraspanins 蛋白质在 exosome 中可能作为一种受体与其他受体或者蛋白质发生相互作用。还有许多种类的蛋白质 通过和 exosome 的膜质发生作用，从而被 exosome 包裹进内部34。除了一些广泛分布的蛋白质
30、外，exosome 内部还有一些细胞种类特南京大学本科生毕业论文10异性的蛋白质。比如，exosome 可以将肿瘤细胞分泌的抗原传递到树突状细胞内。被多种感染在胞内的病原体侵染的细胞分泌的 exosome 被证明含有微生物成分，并且可以促进抗原的呈递和巨噬细胞的激活。细胞也可以通过 exosome释放朊病毒（prion） ， 淀粉样蛋白（beta-amyloid peptide）和 突触核蛋白（alpha-synuclein）35-40。1.3.2 exosome 与 RNA 的相互作用Exosome 可以携带小分子非编码 RNA，比如 miRNA, siRNA, piRNA, snRNA,
31、snoRNA, scaRNA 以及 YRNA；可以携带天然的反义 RNA，tRNA 以及长片段非编码 RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs） 。最值得注意的是exosome 可以有效的携带 miRNA 和 siRNA。Exosome 的 RNA 表达谱和细胞的表达谱并不一致，说明 RNA 被包裹进 exosome 的真个过程是具有选择性的。不同细胞种类分泌的 exosome 中包含的 miRNA，其中有一部分是十分类似的。miRNA 的选择性分泌是一个可能存在的普遍机制。这个普遍机制目前还不清楚，但是近期的研究表明，exosome miRNA 可能是由于某些蛋白质
32、参与的结果，也与靶基因的 mRNA 和转录后修饰有关41-48 。Exosome 所包裹的 RNA 具有十分重要的意义。许多文献报道 exosome 包裹的 RNA 可以被用作医学诊断的生物学指标。例如，肿瘤来源的 exosome 的miRNA 签名（ miRNA signature）可以作为一种潜在的卵巢癌、前列腺癌和成胶质细胞瘤的诊断指标49-51 。Exosome 也可以将 miRNA 通过胎盘送入母体的血液循环中，因此循环 miRNA 也可以作为一种医学上判断妊娠异常的生物学指标52。循环 miRNA 也可以作为炎症和肝脏损伤的生物学指标53,54，同样还可以作为动脉粥样硬化和心脏病医
33、学诊断的生物学指标。在朊病毒感染神经元细胞时，神经元分泌的 exosome 的具有独特的 miRNA 特征，这个发现可以用作朊病毒病的诊断，也为朊病毒病的发病机理提供了线索55。Exosome 内的的 RNA 不仅是一种稳定且方便的生物学指标，而且也是一种供体细胞与受体细胞间的交流方式41。许多研究人员致力于研究肿瘤细胞来源的 exosome 内 RNA 的功能和作用。例如，巨噬细胞分泌的 exosome 可以将miRNA 是送到乳腺癌细胞中56。乳腺细胞也可分泌 exosome，这中 exosome南京大学本科生毕业论文11含有某些特殊组分可以促进与细胞本底无关的 miRNA 的生成，而普通
34、细胞分泌的 exosome 没有这个能力。这种癌细胞分泌的 exosome 可以通过改变正常上皮细胞的转录组来诱使正常细胞发生癌变57。1.3.3 exosome 摄入 RNA 的机理哺乳动物细胞通过多种多样的胞吞作用从循环系统中吸收营养物质、配体物质等化合物，而这类物质运输都是通过内核体前体进行的58。exosome 生成、分泌并被靶细胞吸收的过程随着内核体不断的成熟，内核体的膜向内出芽，从而形成了包含腔内小体的多泡小体。在这个过程中，有些多泡小体开始退化，反向进入高尔基体和内质网网络；有些多泡小体被定位到溶酶体，并且开始消化所包裹的生物分子；还有一些多泡小体沿着微管蛋白移动，与细胞膜融合以
35、后将腔内小体释放进细胞间质，从而形成 exosome。在多泡小体形成，内核体膜向内出芽的过程中，胞质溶胶中的 RNA 也会被摄入，被包裹到腔内小体中59,60。1.3.4 exosome 的靶向性改造在大脑毛细血管壁与神经胶质细胞之间有一层血脑屏障。血脑屏障可以阻止许多物质进入脑组织。siRNA 和普通的 exosome 也不能通过血脑屏障61。南京大学本科生毕业论文12为了给 exosome 特异性靶向组织的能力，我们可以给 exosome 加上特殊的靶向标记，它可以更好的识别某些特殊的组织或者细胞，比如神经细胞和肌肉组织。Lydia Alvarez-Erviti 等人通过给 exosome
36、 加上特殊的融合蛋白的方式赋予exosome 靶向性。通过柔性的甘氨酸软链将某些特殊的靶向短肽与 exosome 表面广泛存在的一种膜蛋白 Lamp 2b 融合，融合位点位于 Lamp 2b 蛋白位于exosome 膜外的 N 端。融合以后靶向短肽会表达在 exosome 的表面。靶向短肽和 exosome 的融合方式如下：结构域从左到右分别为信号肽（signal peptide，SP） 、靶向肽段（Target peptide，TP ） 、跨膜结构域（transmembrane domain，TM） 、C 端（C terminus，CT ） 。狂犬病毒糖蛋白（rabies viral gly
37、coprotein，RVG ）可以特异性靶向中枢神经系统，其中发挥作用的肽段序列为YTIWMPENPRPGYPCDIFTNSRGKRASNG。这段肽段可以和乙酰胆碱受体特异性结合。我们将这段 RVG 肽段作为我们的靶向肽段和 Lamp 2b 蛋白融合，构成了靶向中枢神经系统的 RVG-Lamp 2b 靶向蛋白。将 RVG-Lamp 2b 融合蛋白的表达质粒转到 293T 细胞中，293T 细胞分泌的exosome 表面就会顺利的带上 RVG-Lamp 2b 融合蛋白。这样的 exosome 会被乙酰胆碱受体识别并捕获，从而顺利与神经元细胞融合，将包裹的物质释放入神经元细胞中62 。南京大学本科
38、生毕业论文13第二章 实验部分2.1 exosome 包裹 siRNA 效率测试2.1.1 实验材料：2.1.1 1 细胞系：细胞系 组织来源293T 胚肾组织以上细胞系购自上海生命科学院细胞所2.1.1.2 主要试剂与材料：试剂 厂商Trizol InvitrogenAMV 逆转录试剂盒 TaKaRarTaq PCR 试剂盒 TaKaRa 受体 siRNA（MOR siRNA） 瑞博生物 受体 siRNA 荧光探针 TaqmanRVG-Lamp 2b 表达质粒 金斯瑞2.1.2 实验方法：1. 按照下表转染 293T 细胞RVG-Lamp 2b 表达质粒 MOR siRNA293T exos
39、omes RVG exosomes 24ug 南京大学本科生毕业论文14siRNA exosomes 600pmolRVG siRNA exosomes24ug 600pmol转染后 12 小时观察转染效率，24 小时收集 exosome，4保存。1. 用 Trizol 法提取 exosome 内的总 RNA；2. 检测总 RNA 内的 MOR siRNA 的相对表达量。2.1.3 实验结果：exosome 内 siRNA 相对定量2.1.4 分析：根据文献报道，exosome 内可以包裹 siRNA。本实验验证了前人的这一研究成果。MOR siRNA 可以成功地被 exosome 包裹。2.
40、2 exosome 靶向性实验南京大学本科生毕业论文152.2.1 exosome 体外靶向性实验2.2.1.1 实验材料：（1） 细胞系细胞系名称 组织来源N2a 神经元组织C2C12 骨骼肌组织A549 肺组织HeLa 子宫颈MCF-7 乳腺组织293T 胚肾组织以上细胞系均购自上海生命科学院细胞所（2） 主要试剂与耗材试剂名称 厂商DAPI Beyotime4%多聚甲醛 BeyotimeBLOCK-iT Alexa Fluor Red Fluorescent invitrogen活细胞成像培养皿 江苏百奥特Total exosome isolation Reagent（from cell
41、 culture media）invitrogen2.2.1.2 实验方法：1. exosome 的制备与收集按照以下表格对 293T 细胞进行转染RVG-Lamp2b表达质粒（ug）BLOCK-iT Alexa Fluor Red Fluorescent（pmol）NC 南京大学本科生毕业论文16RVG-exosome 24 siRNA-exosome 600RVG-siRNA-exosome24 600转染后 12 小时观察转染效率，24 小时收集 exosome，4避光保存。2. exosome 与细胞的共培（1） 细胞处理将需要使用的细胞系以 1：600 的比例接种到活细胞培养皿中，培
42、养 24 小时后使用。使用时换成 2%胎牛血清培养基。（2） exosome 与细胞共培对 exosome 进行蛋白定量，按照每个孔 20ug 的比例将 exosome加入活细胞成像培养皿中。37，5%CO 2 培养箱中培养 4 个小时后观察结果。3. 观察（1） 细胞的固定弃去培养基，用 PBS 轻柔的洗涤一次细胞。加入适量的 4%多聚甲醛溶液，完全覆盖住细胞，固定 15 分钟。弃去多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤 2 遍。（2） 细胞核的染色按 1：10000 的比例用双蒸水配置 DAPI 染色液。将 DAPI 染色液加入活细胞成像培养皿中，使之覆盖住细胞。避光染色 5 分钟后，用 PBS
43、洗去多余的染色液。（3） 使用荧光共聚焦显微镜观察荧光结果南京大学本科生毕业论文172.2.1.3 实验结果：N2a：NC RVG siRNA siRNA-RVGC2C12:NC RVG siRNA siRNA-RVG293T：NC RVG siRNA siRNA-RVG南京大学本科生毕业论文18A549:NC RVG siRNA siRNA-RVGHeLa:NC RVG siRNA siRNA-RVGMCF-7NC RVG siRNA siRNA-RVG2.2.1.4 分析本次试验选择的细胞系分别为 N2a，MCF-7，HeLa，A549 ，C2C12，和293T 细胞。其中只有 N2a 是
44、神经元细胞，其他分别为乳腺组织，子宫颈组织，肺组织，骨骼肌组织和胚肾组织，也只有 N2a 细胞是表达乙酰胆碱受体的。在本实验中 N2a 细胞是实验组对象，其他均为对照组。南京大学本科生毕业论文19每个细胞又分别有四组试验，分别为 NC（天然 exosome） 、RVG（表达RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome） 、siRNA（转入 BLOCK-iT Alexa Fluor Red Fluorescent 这一荧光 NC-siRNA 的 exosome）和 siRNA-RVG（表达 RVG-Lamp 2b 融合蛋白同时转入 BLOCK-iT Alexa Fluor Red Fluo
45、rescent 的exosome） 。DAPI 是一种荧光染料，在和 DNA 结合以后可以发出比自身强 20 多倍的蓝色荧光，与双链 DNA 结合时，最大吸收/最大发射波长为 358nm/461nm。在本实验中，DAPI 用于显示细胞核的位置，从而间接显示细胞的位置。BLOCK-iT Alexa Fluor Red Fluorescent 是一种红色荧光标记的 NC-siRNA，其序列与任何已知基因序列均不同源，在荧光显微镜下呈红色，可以用以显示 siRNA 的位置。根据实验图像，我们可以明显看出，在 N2a 细胞中，siRNA-RVG 组与siRNA 组相比，可以检出更多红色荧光；而在其他细
46、胞中，均为 siRNA 组比siRNA-RVG 组检出更多红色荧光。首先，我们可以看到表达 RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome 和不表达RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome 性质上的差异。从 MCF-7，HeLa ，A549 ，C2C12，和 293T 细胞的荧光共聚焦照片中可以看到，普通exosome 可以和细胞正常融合，将内部包裹的 siRNA 释放到细胞内，但是表达了 RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome 却表现出了截然不同的两种表现。对于表达乙酰胆碱受体的 N2a 细胞，表达 RVG-Lamp 2b 融合蛋白的exosome 表现出比普通 e
47、xosome 更强的亲和性，将更多的红色荧光标记的siRNA 送入 N2a 细胞中。但是对于不表达乙酰胆碱受体的其他 5 种细胞，RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome 与细胞的亲和性表现的更弱。由此体外实验可以看出，表达 RVG-Lamp 2b 融合蛋白的 exosome 可以更好的被神经元识别并能更高效的将 siRNA 输送到神经元细胞内。南京大学本科生毕业论文202.2.2 exosome 体内靶向性实验2.2.2.1 实验材料：（1） 绿色荧光小鼠（GFP mouse ）：遗传背景 C57（2） 主要试剂及耗材试剂名称 厂家GFP-122 siRNA mimic 瑞博生物G
48、FP Quantitation Kit Biovision2.2.2.2 试验方法：1. exosome 的制备与收集按照一下表格对 293T 细胞进行转染RVG-Lamp2b 表达质粒（ ug） GFP 122 siRNA mimic （pmol）NC siRNA-exosome 600RVG-siRNA-exosome24 600转染后 12 小时观察转染效率，24 小时收集 exosome，4保存。2. 小鼠尾静脉注射按照 300ug/只的量给小鼠注射 exosome PBS 溶液，每各一天注射一次，一共注射 3 次。3. 小鼠的处死与组织冰冻切片最后一次注射完成一天后处死小鼠，提取小鼠的肝、脾、肺、脑等组织和南京大学本科生毕业论文21器官。将提取出来的组织和器官一半用于冰冻切片，在荧光显微镜下观察组织中绿色荧光蛋白的亮度，另一半用于匀浆后测绿色荧光蛋白亮度。4. 观察（1） 将冰冻切片贴在载玻片上，在荧光显微镜下直接观察。（2） 将组织匀浆
