1、PCR的发明、原理及应用,PCR的发明,Kary B. Mullis ，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法,DNA双螺旋结构于1953年发现 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶于1956年分离成功 自1970年代起，由于发现选择性切割DNA分子的限制性内切酶及接合酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展,1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠
2、杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1984年11月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，
3、这是86年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR的原理,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1.模板DNA的变性：即在高温（93左右）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的53方向延伸，合成DNA新链。重复循
4、环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,PCR反应五要素：即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。,（一）Mg2+ :终浓度为1.52.0mmol/L，其对应dNTP为200 mol/L，注意Mg2+ 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq DNA聚合酶竟争Mg2+ ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2+ 能影响反应的特异性和产率。,（二）dNTP：dNTP具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为 10mmol/L， 各成份以等当量配制，
5、反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（三）Taq DNA聚合酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7075，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。某种dNTP或Mg2+ 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.55个单位/100l。,（四）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与
6、DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（五）引物：引物浓度一般为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。,PCR常见问题,1、模板原因 纯度：含有抑制物 浓度：含量低or太高,2、引物原因引物错误引物设计不好 引物合成、纯化不
7、好,3、PCR条件原因退火温度延伸时间 循环次数,4、非特异性扩增或拖尾,引物特异性差模板和引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,PCR的应用,基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测 SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究,疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）,PCR技术,巢式PCR和半巢式PCR (nested primer PCR) 多重PCR (multiple PCR) 不对称PCR (asymmetric PCR) 锚定PCR （anchored PCR) 反向PCR（inverted PCR) 彩色PCR （color complementation asay) 原位PCR（in situ PCR） 差异显示PCR（differential display PCR） 重组PCR（recombinant PCR） 增敏PCR 定量PCR（quantified PCR） 荧光实时定量PCR技术,
