1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题目： 没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究学 院： 食品科学与工程学院姓 名： 学 号： 专 业： 食品质量与安全班 级： 指导教师： XXXX 职 称：XX二 0 XX 年 X 月没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究目录摘要 . IAbstractII引言 .11 材料与方法 31.1 实验材料 31.2 仪器设备 31.3 实验方法 41.3.1 GASe 溶胶的制备. 41.3.2 GASe 纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定. 41.3.3 细菌培养基的制备 41.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备 .51.
2、3.4 滤纸片法测定 GASe 溶胶抑菌活性. 51.3.5 带毒平板法测定 GASe 溶胶抑菌活性. 51.3.6 半数抑菌浓度 .53 结果与分析 .63.1 GASe 溶胶的浓度测定 63.2 GASe 溶胶抑菌活性 73.4 半数抑菌浓度. 113结论 12参考文献 14致谢 .16没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究摘要本文通过在酸性条件下加热没食子酸(Gallic acid，GA)还原亚硒酸钠制得没食子酸修饰的纳米硒（以下简称“GASe”）。利用高相液相色谱法测定 GASe 颗粒表面的 GA 的浓度后，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法测定其对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌的抑菌效果。结果
3、表明低浓度的 GASe 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌都有抑菌效果，随 GASe 的浓度的增大其抑菌能力随之提高， GASe 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的半数抑菌浓度分别是 0.9710 -4mol/L 和 2.07710 -3 mol/L。GASe的抑菌效果优于没食子酸单体。说明 GASe 有望成为一种高活性的纳米类抗菌抑制剂。关键词：GASe 抑菌作用 半数抑菌浓度I没食子酸修饰的纳米硒抑菌作用研究AbstractIn this paper, gallic acid modified selenium nanoparticle (“GASe“) was prepared by heati
4、ng gallic acid (GA) and Na2SeO3 under acidic conditions. The concentration of GA on GASe was determined by high performance liquid chromatography (HPLC), then using zone of inhibition assay, radial growth assay and turbidity method to determine the antibacterial effect of GASe on E. coli and S. aure
5、us. The results showed that the low concentration of GASe had the antibacterial effect on E.coli and S. aureus, and the antibacterial activity of GASe displayed concentration-dependent behavior. 50% inhibitory concentration (IC50) of GASe to E.coli and S. aureus were 2.077 10-3mol/L and 0.97 10-4mol
6、/L, respectively. The antibacterial effect of GASe was better than that of GA. Therefore, GASe is expected to be a highly active nano antibacterial agent.Keywords: GASe, Antibacterial effect, 50% inhibitory concentrationII没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用引言在我们周围环境中，到处都有各种各样的微生物生存着，绝大多数是对人类无害的微生物，其中有一部分是对人类有害的微生物。金黄色葡
7、萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等是食品、医疗卫生中常见的致病菌。大肠杆菌在食物中超标，不仅会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，还会引起呕吐，腹泻，痢疾等肠道疾病；金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可以起肺炎，心包炎等，甚至败血症，脓毒症等全身感染,严重时会致人死亡。美国疾病防制中心（CDC）指出，金黄色葡萄球菌是目前最难以对付的病菌之一。正由于细菌感染会严重威胁着人类的生命和健康，对这些有害微生物必须采取有效的措施来防止，杀灭或抑制它们。自从抗生素的诞生及广泛使用，许多细菌感染性疾病得到了及时有效的预防、控制和治疗。但是，随着抗生素的大量使用，细菌耐药性菌株越来越多，耐
8、药范围越来越广，甚至出现了一些能对绝大多数抗生素不敏感的超级耐药菌株，这些问题已成为危害人类生存和发展的最大危机。我们国家是世界上抗生素滥用最严重的国家之一，每年约有 8 万人死于抗生素泛滥使用导致的不良反应，且这个死亡数字每年都在不断增加，细菌耐药问题比其他国家更加严峻。因此，研制新型非抗生素类抑菌剂已经刻不容缓。非抗生素抗菌剂的研究开始于 20 世纪 80 年代初 1，近几年，人们研制了许多非抗生素类的抑菌剂，如阳离子聚合物 2-7，抗菌肽 8-10及具有光热杀菌效果的试剂 11,12等等。虽然这些非抗生素药物表现出一定的抑菌作用，但是仍存在一些缺点。例如，阳离子聚合物表现出一定程度的体内
9、溶血，使得其难以作为一个无毒副作用且有效的抗菌物质 13 ，而抗菌肽虽然是天然的抗菌剂，但在生理条件下易被降解。正由于这些问题，寻找安全、有效的非抗生素类抑菌剂已成为医学研究的一个主要目标。没食子酸是一种天然的多酚类化合物，具有抗氧化，抑菌等生物活性 14，具有强还原性，但是没食子酸不稳定，易与空气中的氧气反应变成褐色 15。硒是一切生物所必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，亚硒酸钠对金黄葡萄球菌有抑菌作用，且随浓度的增大抑菌能力增强 16。然而亚硒酸钠毒性大，稳定性差。硒能以多种化学形式存在于生物体内，硒的生物活性和毒性与它的化学形态有关。相对于有机硒和无机硒，红色的零价态纳米硒
10、溶胶具有低毒性，高生物活性和高利用价值 17-18。为获取稳定的纳米硒材料，其有效办法之一是加入无毒安全的表面活性剂作为修饰剂。1没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用纳米粒子间存在不同于常规粒子间的纳米作用能。这种纳米粒子作用能是因为纳米粒子的表面缺少邻近配位原子造成的，使纳米粒子具有很高的活性。随着近年来纳米技术的不断发展，纳米材料类抗菌剂的研究也得到一定的进展，而且纳米材料具备吸附病毒细菌、病毒、有机物的能力 19。以纳米粒子为基础的抗菌剂由于其抗菌特性和在人类的细胞中较低的毒性已成为目前国内外的研究热点 20。没食子修饰的纳米硒可以克服没食子酸易被氧化和亚硒酸钠不稳定及毒性较大等缺点，因此本论
11、文选用没食子酸修饰的纳米硒溶胶（GASe）作为研究对象，通过滤纸片抑菌法，带毒平板法和比浊法研究其抑菌效果。结果表明 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，而且 GASe 溶胶的抑菌效果也比没食子酸单体好。因此，GASe 溶胶有望成为一种有高效、安全的新型抗菌材料。2没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用1 材料与方法1.1 实验材料没食子酸 天津市大茂化学试剂厂亚硒酸钠 郑州鸿祥化工有限公司第一分公司盐酸 西陇化工股份有限公司氢氧化钠 天津欧博凯化有限公祠甲醇（色谱纯） 天津永大化学试剂有限公司磷酸 天津永大化学试剂有限公司蛋白栋 北京奥博星生物技术有限公司牛肉膏 北京奥博星生物技术有限公
12、司琼脂粉 上海山浦化工有限公司氯化钠 天津市大茂化学试剂厂1.2 仪器设备SPECORD 200 紫外可见光分光光度计 德国耶拿分析仪器股份公司JD 1000-2 电子天平 沈阳龙腾电子有限公司立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂HH-BII-600 电热恒温培养箱 上海跃进医疗机械厂GZX-DH-600-S 恒温干燥箱 上海跃进医疗机械厂SW-CJ 系列洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司安捷伦 1260 型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司SYMMETRYC18 色谱柱(4.6nm250nm,5m) 美国安捷伦科技公司BCD-5 50WKM 电冰箱 合肥美的荣事达电冰箱有限公
13、司SHA-C 水浴恒温振荡器 金坛市天竟实验仪器厂90-1 型恒温磁力搅拌器 上海泸西分析仪器厂有限公司3没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用1.3 实验方法1.3.1 GASe 溶胶的制备参考已发表的文献进行 GASe 的合成制备 21。用电子天平称取 0.18814g 没食子酸至 250mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到 100mL，配成 0.01mol/L 的没食子酸储备液。用电子天平称取 0.17294g 亚硒酸钠至 50mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至容量瓶用蒸馏水定容到 10mL，配成 0.1mol/L 的亚硒酸钠储备液。在 25mL 烧杯中按 1：6 的浓度加入
14、Na2SeO 3 与没食子酸，利用盐酸将 pH 调至 3.0后，加热挥干后得到橙红色固相样品。将此样品加蒸馏水溶解，在透析袋中过夜透析除去未反应的没食子酸后，定容于 10mL 容量瓶中得到 GASe 溶胶。1.3.2 GASe 纳米颗粒表面负载的没食子酸浓度的测定用电子秤称取 2mg，4mg，6mg，8mg，1.0mg 没食子酸至小烧杯后加入 10mL 超纯水溶解，得到 0.2mg/mL,0.4mg/mL，0.6mg/mL ,0.8mg/mL,1.0mg/mL 的没食子酸溶液。取 2mLGASe 溶胶至离心管中， 1 万转/min 离心 10 分钟后取上清液 10L 进样。将以上配制好的 5
15、种不同浓度的标准品没食子酸溶液分别进样，每种浓度进样 3 次，每次进样 10L，每次进样前经滤膜过滤，测定峰面积。将上清液稀释 5 倍后再进样。以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算出 GASe 溶胶中没食子酸的浓度，从而计算出 GASe 的浓度。色谱条件：SYMMETRYC 18 色谱柱(4.6nm250nm ,5m)柱温 30，流动相为 V(甲醇)：V（0.05%H3 PO4）=15：85 溶液，检测波长为 273nm ，进样量为 10L。1.3.3 细菌培养基的制备称取 0.5g 牛肉膏，1g 蛋白胨及 0.5g 氯化钠溶解定容到 100mL，调节 pH
16、至 7.2（配制固体培养基需加入 1.52g 琼脂粉），在 0.1MPa 下高压灭菌 20min，备用22。4没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用1.3.4 菌株的活化和菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌菌种和大肠杆菌菌种接入试管斜面上，在 37的恒温培养箱内培养 24 小时后，置于 4冰箱中冷藏备用。将 2 个配制好的 100mL 液体培养基经过121高压灭菌 20min，在室温下冷却至不烫手。在无菌条件下，用接种环挑取一环置于液体培养基中，于 37恒温培养箱中培养 24 小时作为种子液，不用时置于 4冰箱中冷藏备用。1.3.4 滤纸片法测定 GASe 溶胶抑菌活性选用优质滤纸片直径为 6mm 的圆形纸
17、片分别装入 6 个小离心中，其中 3 个分别加入 50L，100L，150L 的 GASe 溶胶，另外三个加入相同量相同浓度的没食子酸溶液，置于 62.5的烘箱中烘干。取菌悬液 0.2mL 转移至之前倒好的平板培养基表面，涂布均匀，制成含菌平板。将烘干的滤纸片贴入含菌平板，每个平板贴 3 片。在 37 的恒温培养箱中培养 24 小时后观察它们的抑菌效果。1.3.5 带毒平板法测定 GASe 溶胶抑菌活性移取 0.2mL 金黄色葡萄球菌菌悬液到 10 个经 0.1MPa 高温灭菌 20min 的培养皿，移取 0.2mL， 0.4mL，0.6mL ，0.8mL ，1.0mLGASe 溶胶到已灭菌的
18、装有 14.8mL，14.6mL，14.4mL ，14.2mL，14mL 培养基的小锥形瓶中得到 GASe 浓度分别为2.414610-5mol/L,4.829010-5mol/L,7.243410-5mol/L,9.657810-5mol/L ，12.072310-5mol/L 的带毒平板。对照组用等量的无菌水代替 GASe 溶胶，其它不变，迅速摇匀，将培养基倒入培养皿中，贴好标签。放入 37的恒温培养箱中培养 24 小时，观察结果。制备好大肠杆菌的菌悬液后，用相同的方法进行测定 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌活性。1.3.6 半数抑菌浓度培养基中含有 GASe 溶胶的吸光值的测定：分别移取
19、 0.1mL，0.2mL ，0.3mL，0.4mL ，0.5mLGASe 溶胶到已灭菌的装有液体培养基 4.9mL，4.8mL，4.7mL，4.6mL，4.5mL 的试管中，在 37的振荡器中振荡 8 小时，在 600nm 处测定吸光值，以 GASe 的浓度为横坐标轴，以吸光值为纵坐标轴根据 GASe 的浓度和吸光值的关系，绘制5没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用标准曲线。半数抑菌浓度的测定：分别移取 0.1mL，0.2mLGASe 溶胶到已灭菌装有液体培养基 4.9ml,4.8ml 的试管中,向每个试管移取 0.1mL 的金黄葡萄球菌的菌悬液使得 GASe 浓度分别是 3.490210-4mol
20、/L，6.980310 -4mol/L。在 37的振荡器中培养 8小时，观察其浑浊度。分别移取 10L，30L，50L，70L ，90LGASe 溶胶到 6 个分别装有已灭菌的液体培养基 5ml 的试管中，向每个试管移取 0.1ml 的金黄葡萄球菌的菌悬液使得 GASe 浓度分别是 0.348310-4mol/L ， 1.04110-4mol/L ，1.728210 -4mol/L，2.410110 -4mol/L，3.086710 -4mol/L。在 37的振荡器中培养 8 小时。对照组用等量的无菌水代替 GAse 溶胶，其它不变。观察浑浊度以及在 600nm 处测定吸光值。此方法平行测定三
21、次。分别移取 1.1mL，1.2mL GASe 溶胶到已灭菌的 3 个装有液体培养基 4mL 的试管中，向每个试管移取 0.1mL 的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是 3.765410-3mol/L，4.030210 -3mol/L。在 37的振荡器中培养 8 小时，观察浑浊度。分别移取 0.6 mL， 0.7 mL， 0.8 mL，0.9 mL，1 mLGASe 溶胶到已灭菌装有液体培养基 4.4 mL，4.3 mL，4.2 mL，4.1 mL，4 mL 的试管中，向每个试管移取 0.1mL 的大肠杆菌的菌悬液使得 GASe 的浓度分别是 2.094110 -3mol/L ，2.
22、443110 -3mol/L ，2.792210-3mol/L，3.141210 -3mol/L，3.490210 -3mol/L。在 37的振荡器中培养 8 小时。对照组用等量的无菌水代替 GAse 溶胶，其它不变。观察浑浊度以及在 600nm 处测定吸光值。此方法平行测定三次。GASe 溶胶的吸光值记为吸光值 1，对照组的吸光值记为吸光值 2，含有 GASe溶胶和细菌吸光值记为吸光值 3。根据公式：抑菌率(%)=吸光值 2-( 吸光值 3-吸光值1)/吸光值 2，以 GASe 浓度为横坐标，以抑菌率为纵坐标，绘制标准曲线，并依据回归方程计算出抑菌率为 50%时的浓度即为半数抑菌浓度。3 结
23、果与分析3.1 GASe 溶胶的浓度测定采用高效液相色谱法检测 GASe 纳米粒子表面所负载的没食子酸浓度。的标准曲线图如图 1，根据没食子酸的回归方程 y=26266x-920.44 和 GASe 溶胶上清液释释5 倍后所得峰面积为 5522.5 计算出 GASe 溶胶中纳米颗粒表面所负载的没食子酸浓6没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用度为 0.0178mol/L。图 1 没食子酸标准曲线3.2 GASe 溶胶抑菌活性采用滤纸片法检测 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果,实验结果如图 2 所示，GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈非常明显，说明 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌
24、效果，而且在一定的浓度范围内，随浓度的增大 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈越大。单独的没食子酸基本没有观察到抑菌圈，说明 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较没食子酸单体抑菌好。A:50LGA D:100LGA G:150LGAB:50LGASe E:100LGASe H:150LGASeC:空白 F:空白 I:空白图 2 GASe 溶胶与没食子酸对金黄色葡萄球菌的抑菌效果GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌效果如图 3 所示，GASe 溶胶对大肠杆菌有抑菌效果，但相对于金黄色葡萄球菌，其对大肠杆菌的抑菌效果更差一点。当 GASe 溶胶浓度达到一定量时，随 GASe 溶胶浓度的增大,G
25、ASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌效果没有明显的变化。同样，单独的没食子酸基本没有观察到抑菌圈，说明 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌效果较没食子酸单体抑菌好。7没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用J:空白 M:100LGASe P:150LGASeK: 50LGASe N：100LGA Q:150LGAL:50LGA O：空白 R:空白图 3 GASe 溶胶与没食子酸对大肠杆菌的抑菌效果采用带毒平板法检测 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌活性，从下列图 4 可以看出，GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌活性明显，当浓度大于 7.243410 -5 mol/L 时，GASe溶胶可以抑制生长旺盛的大肠杆菌，在平板当中
26、基本观察不到大肠杆菌的菌落的存在，而且随着 GASe 溶胶浓度的增加，抑菌效果也随之增强。GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性如图 5 所示，GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性非常明显，当浓度大于 4.829010 -5 mol/L 时，GASe 溶胶可以抑制生长旺盛的金黄色葡萄球菌，在平板当中基本观察不到金黄色葡萄球菌的菌落的存在，而且随着 GASe 溶胶浓度的增加，抑菌效果也随之增强。相对于大肠杆菌来说，金黄葡萄球菌对 GASe 溶胶更敏感。8没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用Control GASe9没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用Control GASe10没食子酸修饰的纳米硒的抑
27、菌作用3.4 半数致死浓度通过肉眼直接观察加入了 GASe 溶胶的菌悬液的浑浊程度，来初步筛选出 GASe 溶胶抑制金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的浓度。从下图表 1 和表 2 可以看出 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果很好，当 GASe 的浓度大于 3.490210-4mol/L 对金黄色葡萄球菌的抑菌率达 100%。然而，GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌效果不如金黄色葡萄球菌，当 GASe 的浓度大于 3.765410 -3mol/L 对大肠杆菌的抑菌率才达 100%。表 1 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌作用浓度(10 -4mol/L) 1.041 1.72282 3.0867 3
28、.4902 6.9803对照 + + + + +金黄色葡萄球菌 + + + - -表 2 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌作用浓度(10 -3mol/L) 2.7922 3.1412 3.4902 3.7654 4.0302对照 + + + + +大肠杆菌 + + + - -注：+表示液体浑浊，-表示液体澄清。在通过肉眼直接观察确定 GASe 溶胶抑制金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的浓度的基础上，初步确定 GASe 溶胶对大肠杆菌的半数抑菌浓度分别低于 3.765410-3mol/L，GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的半数抑菌浓度低于 3.490210 -4mol/L。由于 GASe 溶胶呈现砖红色，所
29、以 GASe 溶胶对实验组的吸光度造成影响，所以我们首先检测了实验组培养基所含 GASe 溶胶的吸光度。含 GASe 溶胶的液体培养基的标准曲线如图 6，根据回归方程 y=0.0312x+0.1299 可以知道用液体培养配成的不同浓度的 GASe 溶胶的吸光值。在 600nm 下检测加入 GASe 溶胶的菌悬液的吸光度，不同浓度的 GASe 溶胶对大肠杆菌的抑菌率的标准曲线如下图 7，由回归方程 y=34.198x-21.305 得， GASe 溶胶对大肠杆菌的半数抑菌浓度是 2.07710-3mol/L。不同浓度的 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌率的标准曲线如下图 8，由回归方程 y=
30、23.407x+27.285 计算得出 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的半数抑菌浓度是 0.9710 -4mol/L。 GASe 溶胶对金黄色葡萄球菌的半数抑菌浓度小于大11没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用肠杆菌。图 6 液体培养基中 GASe 的吸光度图 7 对大肠杆菌的抑菌率图 8 对金黄色葡萄球菌的抑菌率3 结论本论文实验结果表明低浓度的 GASe 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效12没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用果，而且 GASe 对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌，半数抑菌浓度分别是0.9710-4mol/L 和 2.07710-3mol/L。另外，GASe 的抑菌效果优于相同
31、浓度的没食子酸单体，说明纳米颗粒表面的没食子酸对 GASe 抑菌效果有一定的影响，但其抑菌原理还不清楚，仍需进一步研究。13没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用参考文献1孙洪, 夏英, 陈莉, 谭振宇, 孟令懿. 国内外抗菌剂的研究现状及发展趋势J. 塑料工业, 2006,09:1-17.2 N. Smiramoth, C.D. Meo, F. Zouhiri, F. Sad-Hassane, S. Valetti, R. Gorges, et al., Self-assembled squalenoylated penicillin bioconjugates: an original appro
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42、timicrobial agents against superbugsJ. Acta biomaterialia, 2016,30: 397407.21钟彩玲. 纳米硒界面对草酸钙晶体生长的调控作用D. 暨南大学,2014.22帅丽乔娃 , 郑国栋 , 张清峰 , 黎冬明 . 菝葜提取物的抗氧化作用 J. 江苏农业科学 , 2015,09:346-349.15没食子酸修饰的纳米硒的抑菌作用致谢在本论文的撰写过程中，要特别感谢我的导师杨丽聪老师的精心指导和督促，同时感谢她的耐心和理解。导师丰富的实验经验和扎实的理论基础为本人论文顺利完成铺平了道路。同时，感谢熊磊等学长学姐和身边同学提供的帮助、建议。在这四年的求学历程中结识各位同学和老师让我得到了人生中最大的一笔财富，谢谢各位同学在生活和学业上给予的帮助和关心，谢谢老师们在这四年中为我们传道、授业、解惑。最后，感谢所有关心和支持我的人。16
