1、1高效毛细管电泳法在体内药物分析中的研究进展2110707659 药物分析 刘怀永 【摘要】介绍高效毛细管电泳(HPCE)近年来在体内药物分析领域的应用情况。样品的前处理，HPCE 的类型和基本原理，及其在体内药物分析中的应用，并展望未来，得出高效毛细管电泳技术具有高效、快速，分离模式多等特点，在体内药物分析中具有广阔的应用前景。【关键词】 高效毛细管电泳；体内分析；应用体内药物分析是由药物分析学派生出来的一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量的变化规律的新兴学科 1。体内药物分析特点是样品成分复杂，被测组分含量低等。因此，其发展与生物样品处理技术、分离技术、检测技术密切相关，并
2、随着这三大技术的发展而发展。体内药物分析学已成为药学前沿最活跃的领域之一。高效毛细管电泳(HPCE)又叫毛细管电泳(CE)，是必高压电场为驱动力，以毛细管及其内壁为通道和载体，利用样品各组分之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。目前已广泛应用于生命科学、生物技术、临床医学、药物学和环境保护等领域。采用HPCE法能数秒至数分钟内可冲洗再生，不易污染，能直接进样水溶性蛋白样品。此外，它呵在185210 nm波长下进行监测，因其避免了高效液相色谱仪(HPLC)在短紫外波长测定时易受到所用溶剂截止波长的干扰，这样就可测定分子中不带生色团的药物，扩大了监测范围 2，这些优点与传统药物
3、分析方法相此更突出了HPCE在这一领域巾的优势地位，使毛细管电泳在体内药物分析领域有着极其广阔的应用前景。1 样品的前处理在体内药物分析中，生物样本成分复杂，除被测组分外，往往含有大量内源性物质、代谢产物及共存药物等干扰物质，且被测组分的含量往往处于ug至ng级甚至更低水平，大多现有的分离分析技术尚不能对这样的复杂体系直接进行检测，生物样品中的药物必须经过分离、纯化、富集，必要时还需对待测组分进行化学改性处理，因此，样品的预处理就显得尤为关键，它通常是整个分离分析过程中最为繁琐的一个环节。传统的生物样品处理方式如沉淀蛋白、离2心和过滤、液-液萃取等虽还在广泛使用，但它们或不利于在线处理，实现自
4、动化，或需要消耗大量有毒试剂，不利于环保和操作人员的身体健康。近年来，随着固相萃取技术(SPE)、固相微萃取技术(SPME)、微透析取样技术(MD)等多种新技术新方法的采用，使得生物样品的处理技术向着低污染、低用量、高选择、高通量、自动化、在线化方向发展 3。2 HPCE的几种类型HPCE可分析的成分小至无机离子，大至生物大分子，如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPCE分析高效、快速、微量。根据其分离样本的原理分为毛细管区带电泳(Capillary ZoneElectrophoresis，CZE)；毛细管等速电泳(Capillary Isotachph
5、oresis，CITP)毛细管胶束电动色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatograpy，MECC或MEKC或CMEC)；毛细管凝胶电泳(CapmaryGel Electrophoresis，CGE)；毛细电聚焦(CaNllary Isoelectric Focusing，CIEF)、毛细管电色谱(Capillary ElectroChromatograpy，CEC)等几种类型，还有微乳毛细管电泳和非水毛细管电泳等新类型。CZE、CGE、CITP及CIEF的分析对象为可解离的物质或带电荷的物质，适用于分离生物碱类、有机酸类、氨基酸类、核酸类、多
6、肽以及蛋白质类、黄酮及其苷类、香豆素类等化合物。CZE常用来测定肽谱(蛋白质的一级结构的指纹图谱)，CGE常用于测定蛋白质或肽类的分子量，CIEF常用于测定蛋白质的等电点和蛋白质的富集。MECC可分析中性分子，适用于各类物质的分析 4。目前CZE和MECC用得较多。3 HPCE的基本原理3.1 CZE的基本原理HPCE选用的毛细管一般内径约50um(20um200um)，外径375um，有效长度50 cm(7cm100cm)，以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间浓度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细
7、管两端插入而又可和3电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。HPCE所用的大理石英毛细管柱，在pH3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流二致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实
8、现分离。3.2 MECC的基本原理MECC是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)加到缓冲液中，当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电，但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度，故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在二相中分配就有差异，疏水性强的和胶束结合牢，流出时间就长，最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使HPCE能用于中性物质的分离，拓宽了HPCE的应用范围，是对HPCE极大的贡献 5。4 HPCE法的应用4.1 体内药物检测HPCE适应于多种临床常规用药的检测。史
9、爱欣等 6引建立了人血浆中班布特罗及其代谢物特布他林血药浓度的高效毛细管电泳测定方法。采用固相萃取的方法进行班布特罗及其代谢物特布他林的提取。结果班布特罗及其特布他林峰形良好，且血浆组分无干扰峰，采用普萘洛尔为内标，班布特罗测定的线性范围为16125 ugL,特布他林测定的线性范围为403125ugL。李朵璐等 7对左氧氟沙星(LVFX)和多索茶碱(Dox)合用在大鼠体内的药代动力学进行研究。用胶束电动毛细管电泳法(MECC)检i911Dox的血药浓度。测定了单用和合用Dox的药代动力学参数，结果表明单用和合用Dox，均符合二房室模型。44.2 药代动力学研究余丽宁等 8建立了快速、准确测定大
10、鼠血浆中马来酸曲美布汀浓度的HPCE方法，并用于其在大鼠体内的药物动力学研究。以盐酸麻黄碱为内标，0.03molL磷酸二氢钠(pH一6o)为运行缓冲溶液，紫外检测波长为214nm。血浆样品经乙腈除蛋白后，于50 C水浴用氮气吹干，残渣溶于甲醇水(1:1),进样分析。线性范围5ugL200ugL,日内RSD14，日间RSD13，回收率为728879，最低定量浓度为5ugL。ig给药30 min后，血浆中药物浓度达峰值，T l2 (Ke)为173 min，Ke为5610 -3min，AUC为783ug(minm1)。该方法灵敏度高，操作简便，适用于马来酸曲美布汀的药物动力学研究。4.3 手性药物的
11、拆分与监测据估计，常用的200多种药物中，一半以上至少具有1个手性中心，而这些药物中的7590是以外消旋体形式在市场销售，手性药物异构体间的药理活性往往存在质和量的差异。手性药物的拆分和监测也受到越来越多的关注，为了准确了解这些药的药效和安全性，有必要对手性药物的各个异构体进行分离并分别考察各自的生理活性；刘会臣，于洋等 9研究反式曲马朵(transT)及反式氧去甲基曲马朵(M1)在大鼠胆汁中排泄的立体选择性。以高效毛细管电泳法测定大鼠ivtransT或MI后胆汁和血浆中transT，MI和与葡糖醛酸结合Ml(Mlc)的对映体。结果表明transT署HM 1在大鼠胆汁中排泄具立体选择性，(+)
12、transT和(一)Ml被优先排泄。李晓海等 10_叶荻碱的高效毛细管电泳手性分离及其大鼠体内立体选择性代谢研究以羟丙基-B-环糊精(HP-B-CD)为手性选择剂，测定条件为：分离介质32mmolL HP-B-CD的Tris H 3P04缓冲液(40mmolL，H 3P04调pH=6.0)；分离电压15kV，柱温16C，压力进样6s，检测波长254nm；大鼠各生物样品碱化后乙酸乙酯萃取。测定条件下SE基本达到基线分离，大鼠生物样品测定不受内源及代谢物干扰。大鼠ipSE经胆汁、尿和粪排泄以d型为主，具有立体选择性。5 HPCE在体内药物分析的应用展望目前，体内药物分析中如药代研究、治疗药物监测、
13、滥用药物测定等分析方5法主要还是应用HPLC，但采用HPLC法时样品预处理既费时又费力，平衡时间和分析时间较长，试剂耗费多；从发展趋势看，HPCE具高效、廉价、环保之优点，适于普及。医药领域内大量研究工作已经表明，HPCE已逐步走向成熟，将其与各分析技术的联用如同质谱的联用，以及随着辑种新的缓冲试剂的合成、新的进样方法和检测方法的不断完善，HPCE将不断扩大应用领域，具有广阔的研究前景。目前HPCE已发展有几种新的分离模式，芯片毛细管电泳(CCE)、阵列毛细管电泳(CAE)、亲和毛细管电泳(ACE)、毛细管电泳仪与其他仪器的联用(HPCEMS，HPCENMR)等，所有这些发展都将使HPCE技术
14、日臻完善 11。Thormann W等12分别将毛细管区带电泳(CZE)和毛细管电色谱(CEC)与NMR仪联用，测定尿液中的对乙酰氨基酚及其代谢物。受试者服药1g后，3h内取尿样，加入甲醇2 HCl溶液，先在C18固相小柱上进行预处理，再用酸洗脱进行分析。CZE采用内径80zm的毛细管柱，进样8 nl，CEC采用内径为250弘m的填充毛细管柱，进样500 nl，NMR仪频率600 MHz，检测出了药物的主要代谢物及内源性的马尿酸盐，分离效率高且物质结构明确，令人满意。可以预言，经过科学工作者的不懈努力及深入研究，CE技术将得到不断发展和完善，随着商品化仪器的不断改进，CE将成为体内药物分析的重
15、要工具。参考文献1 李好枝.体内药物分析M北京：中国医药科技出版社,2004,32 罗国安，王望明.毛细管电泳在临床检验中的应用J中华医学检验杂志，1996，19(5):823 汤建林，周世文. 体内药物分析技术的研究现状及展望J.重庆医学，2008,37(8):876-879.4 刘翔，赵炽彬. 高效毛细管电泳法在体内药物分析的应用J. 中国卫生产业,2011,8(6):108-110.5牛其云，徐冰. 高效毛细管电泳及其在体内药物分析中的应用J. 实用医技杂志，2005,12(6):1441-1443.66 史爱欣，李可欣，曹国颖，等高效毛细管电泳法测定班布特罗及其代谢物特布他林的血药浓度
16、J药物分析杂志，2001，21(4)：2917 李朵璐，阚全程大鼠体内左氧氟沙星对多索茶碱药代动力学的影响J中国药业，2004，13(1)：428余丽宁，李发美大鼠血浆中马来酸曲美布汀的HPCE测定法及药物动力学J.药学学报,2001,36(2):1319 刘会臣,于洋,王娜,等.反式曲马朵和反式氧去甲基曲马朵在大鼠胆汁中排泄的立体选择性J药学学报，2003，38(6)：41210 李晓海，张金兰，周同惠叶荻碱的高效毛细管电泳手性分离及其大鼠体内立体选择性代谢研究J药学学报，2002，37(1)：5011 张慧文，何丽明. 高效毛细管电泳法在体内药物分析的应用J. 中国医院药学杂志,2007,27(8):1132-1136.12Zhang CX，Acbi Y，Thormann WMicroassay of amiodarone and desethylamiodarone in serum by capillary electrophoresiswith headcolumn field amplified sample stackineJClinChem，1996，42(11)：1805
