1、.页眉.页脚学号：091201215分子生物学实验论文(2009 级本科)题 目：氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究 系（部）院： 农业与生物技术学院 专 业： 生物工程 作 者 姓 名 ： 何增寿 完 成 日 期 ： 2011 年 12 月 10 日 二 零 一 一 年 十 二 月.页眉.页脚氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究（农业与生物技术学院 工程 09（2）班 何增寿 091201202）摘要：为研究人工合成的氨苄青霉素在大肠杆菌中的抗性表达，利用 PGEM-Teasy 质粒为载体，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出抗氨苄青霉素的基因的大肠杆菌，对
2、筛选出的大肠杆菌进行质粒 DNA 提取,并对质粒进行 PCR 扩增和酶切电泳图分析。结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中表达并复制。关键字：氨苄青霉素 抗性 大肠杆菌 研究引言：在分子生物学日益普及的今天, 基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA 重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达, 从而得到大量的重组基因。其中尤以转化为主。目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物: 第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞, 其转化效率十分可靠, 一般可以达到108 的转化子/g 质粒DNA, 但是相当昂贵, 通常选择的是自制感受态细胞的储存物。因此, 感
3、受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节, 其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM-Teasy质粒 Taq酶1.1.2 仪器：基因扩增仪 移液器 电泳仪 紫外检测仪 恒温摇床 恒温水浴器 恒温培养箱 低温离心机 超净工作台 冰箱 离心管 小指管 1.1.3 试剂： PCR 缓冲液(含 Mg2) 4 种 dNTP Taq 酶 DNA 模板两种引物（正向引物和反向引物） EB 溶液 氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素 氯化钙(CaCl2) 酒精灯 牙签 LB 液体培养基 ddH2O 溶液（50 mmol/
4、L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA） 溶液 0.4mol/L NaOH，2%SDS 用前等体积混合 溶液 5 mol/L KAc 溶液 60ml， 11.5 ml 冰醋酸，28.5 ml 去离子水。 Tris.HCl RNase 溶液 .页眉.页脚1.2 方法1.2.1 PCR 基因扩增1.2.1.1 按顺序向微量离心管中依次加入：ddH2O 35lDNA 样品 1l10PCR 缓冲液 5l2.1mmol/L dNTP 4l引物 I 2l引物 2l混匀。1.2.1.2 PCR 反应参数(1) 94预变性 5min(2) 94变性 1min(
5、3) 47退火 1min(4) 72 延伸 2min。(5) 重复(2)-(4) 30 次（6）72 延伸 10min。（7）4保存1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 的结果：取 10l PCR 扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流 40mA。电泳结束后，用 EB 染色 15min，紫外灯下观察结果。1.2.2 DNA 重组1.2.2.1 取灭菌的 EP 管，先后加入 PGEM-Teasy 质粒 1 l ，2 l 酶切缓冲液， 1 l E.coRI 酶，无菌双蒸水 15ul，至反应混合物总体积 20ul，离心混匀，37反应 3h。1.2.2.2 在另一灭菌的 Eppendorf 管中
6、，加 DNA 1.5ug， 1l 酶切缓冲液，1 l EcoRI 酶，无菌双蒸水补到 10ul，37反应 3h。1.2.2.3 将酶解液加入 1/10 体积的 3mol/LKAc 溶液，在加 2 倍体积无水乙醇，-20冰箱，2h 沉淀 DNA。12000r/min 4离心 15min，弃上清，加 70%乙醇洗.页眉.页脚沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加 5ulTE 溶液。1.2.2.4 将酶切后的 2 个 DNA 片段混合于一管中，加 T4DNA 连接酶缓冲液1ul，T4DNA 连接酶 1ul，14保温 14h，并作转化试验。1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1.2.3.1 从大肠
7、杆菌平板上挑取一个单菌落接于 3mlLB 液体培养基试管中， 37振荡过夜。1.2.3.2 取 0.5ml 过夜培养液，接种于 50ml LB 液体培养基中，37振荡培养2-3h，至 OD600=0.4-0.5 时，放置于 4冰箱冷却 1-2h。 （注：以下操作均应在冰浴中进行。 ）1.2.3.3 将培养液 1ml 分装入 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10-30min 于 4离心，4000r/min10min，弃去上清。1.2.3.4 用冰浴的 0.1mol/LCaCl2 20l 悬浮。1.2.3.5 4离心，4000r/min10min，弃去上清，加入冰浴的 0.1mol/LCaCl2
8、-甘油溶液 200l 悬浮于冰上 20-30min。4离心，4000r/min10min，弃去上清。1.2.3.6 分装细胞，每 200ul 一份，-70冻存备用，此为感受态细胞。取新鲜制备的 200L 感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入 2l 重组质粒，轻轻混匀。冰上放置 30 分钟。7.200ul 0.1mol/l CaCl2 +2ul PEGM-Teasy 质粒 DNA 溶液混合。1.2.3.7 于 42热休克 90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴 1-2min1.2.3.8 每管加 800 -900 l LB 培养液，37 250rmin 振荡培养 1h。1.2.
9、3.9 将培养物适量涂于含氨苄青霉素 1%琼脂 LB 平板上。1.2.3.10 平皿在 37下正向放置 30min，待琼脂凝胶表面没有液体流动后，将平皿倒置，培养过夜 12-16h 出现菌落。1.2.4 质粒 DNA 的提取及酶切1.2.4.1 提取质粒1.2.4.1.1 将 2ml 含相应抗生素（Amp：50ug/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入上述的含 pUC19 质粒的大肠杆菌，37震荡培养过夜1.2.4.1.2 取 1.5ml 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。.页眉.页脚1.2.4.1.3 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥1.2.4.1.4 弃上
10、清，加 100l（5 mg/ml 溶菌酶）溶液，旋涡震荡悬浮菌体，室温放置 10min。 1.2.4.1.5 加 200l 的溶液（新鲜配置） ，轻轻混匀，冰浴 5 min。 1.2.4.1.6 加 150l 的溶液，混匀，冰浴 15 分钟。1.2.4.1.7 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。1.2.4.1.8 向上清液中加等体积 酚：氯仿（1：1） （去蛋白） ，反复混匀，12000r/min，离心 5min，将上清转至另一离心管中。1.2.4.1.9 吸取上清，加 2 倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置 510min。 120000 r/min 离心 5
11、min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。1.2.4.1.10 用 1ml 70乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，振荡并离心，弃上清，晾干。1.2.4.2 酶切取 5ug DNA 溶液，加 1ul（2U）,无菌水补至总体积 10ul，37保温 3h，加凝胶上样缓冲液（6x）2ul，准备下个试验进行电泳，分析质粒 DNA 的限制性酶切图谱。2 结果与分析2.1 PCR 目的基因的扩增电泳图的分析.页眉.页脚图一：PCR 目的基因的扩增电泳图由上图可以看出，条带与标准 maker 对比可知目的基因的分子量在 1000 左右，条带没有拖拉的痕迹表明 PCR 效果较好，其中 PCR 扩增产物中目
12、的基因的纯度较高，与 maker 中分子量为 1000 的条带对应也出现了条带，表示其中含有杂质，即体系中还有为延伸完成的目的基因又一次被变性了。2.2 重组后的质粒导入大肠杆菌后在含氨苄青霉素的培养基上生长的分析.页眉.页脚图二：重组后的质粒图从上图可以看出，利用 Cacl2 法制备大肠杆菌感受态细胞在导入重组 DNA 质粒后，在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明导入的目的基因表达了。2.3 质粒凝胶电泳分析图三：质粒凝胶电泳图图中泳道一是我组的泳道，与其他泳道相比条带的亮度较浅原因有以下两点：1、点样量太少；2、提取质粒的纯度不高2.4 质粒 PCR 和质粒酶切分析.页眉.页脚图四：质粒
13、PCR 凝胶电泳图 图五：酶切 PCR 凝胶电泳图DNA 经酶切和扩增后显示不同长短的条带，PCR 扩增产物后分子量为 900 左右的仅有一条带而经酶切后有三条带，因此表明质粒的分子量为 4000 左右与理论基本符合。1.3 参考文献1 任杏芬. 大肠杆菌 J. 生物学通报 , 1993, (04)2朱必凤, 杨旭夫, 刘主, 彭凌, 邓小亮. 6 株副猪嗜血杆菌基因组 DNA 的 PCR 指纹图谱研究J. 中国预防兽医学报 , 2007,(03)3 李芳, 墙克信 , 王玉炯. 大肠杆菌感受态细胞制备方法及应用的研究进展J. 宁夏医学院学报 , 2003,(05)4 李路怡,易建华,李敏. 大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨 J. 生命科学研究 , 1998,(03) .
