1、2006年33(6) 微生物学通报哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究。李梅云1 谭丽华2 方敦煌1 李天飞3 王 革3 刘开启4(云南省烟草科学研究所玉溪653100)1 (鲁南制药股份有限公司 临沂276003)2(玉溪红塔集团玉溪653100)3 (仲凯农业技术学院资源环境系广州510225)479摘要：哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH一1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢，其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上，菌丝生长适宜温度27535，最适温度325，产孢最适温度275。菌丝生长适宜pH值为37，产孢适宜pH值为59，生
2、长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量，光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH一1明显抑制疫霉菌的生长速率，其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发，并抑制游动孢子芽管的伸长，TH一1对游动孢子萌发的相对抑制率为127，对芽管生长长度的相对抑制率为631。水解酶平板活性测定显示，TH1产生81，3葡聚糖酶与纤维素酶，从而使烟草疫霉菌细胞壁的消解，产生非挥发性抗生素抑制烟草疫霉菌孢子萌发，但对菌丝生长影响不大。关键词：哈茨木霉，培养条件，烟草疫霉，抑制作用中图分类号：s43572 文献标识码：A 文章编号：02532654(2006)06JD079-05C
3、ultuml Characteristics of乃妇五。如瑚口砌圪缸删m and its Inhibition to脚f叩fo，n以站of缸n口P+U MeiYunl TAN LiHua2 FANG DunHuan91 u TianFei3 WANG Ge3 uU KaiQi4(凰疵砒矿乃65沈M庇M砌，施653100)1 (如mn砌“施z凸，三仞，厶吲276003)2(i胁蟛o Gro印，i 653100)3()号Pnn榭眦矿尺郫o“rce nnd E删imn，聊眦oz sc拓，配e，zho，l咖反Agro船曲n如nz cozz号ge，GHnn兽如o510225)4Abstract：m如。
4、出m。a谢肌um is one kind of important biocomIDl agent against plant diseases Thero蕊znMm TH一1 is粕active antagonistism against P坳0phfom凡如o缸，啪The cultural chamcteristics of TH1 on 4 amfical media and its inhibition of Pn幻of如凡伽were studiedThe data showed that it grew faster and pr0一duced more spores on PDA血
5、an on the other media Its optimum growth tempemture mnged f而m 275to325and tlle 0ptimum initial pH was 51umination had no innuence 0n hyphae growth but it can stimulatespomlationThe pathogen growth 0f Pn如oi彻ne was suppressed obviously by TH一1 in dual cuIturesThe resultsof the zoospore genination expe
6、riment showed that the ceUfree filtrate of TH1 can obviously suppress thezoospores ge珊ination and extention of the pathogen，the inh击mon mte was 127a11d 631respectiveIyHi曲enzymatic activity of p一1，3一gluc趴ases and cellulases produced by TH一1 was detected，wl】ich can degradethe ceU wall of the plant pat
7、hogenic fhngus7111e resuhs of metabolites deterrnination showed that the丁h2“der，zoisolate produced nonV01atile antibiotics to suppress the ge珊ination of zoospore of P nicofi8noe but no ef托ct onthe hyphal grow山of P n七ot缸noeKey words：，Hcode丌7l，五nnHm，Cultural conditions，P坳叩琥om凡髓m施n础，Inhibitory action+由
8、国家烟草专卖局、云南省科委及云南省烟草公司资助(No99A22)通讯作者 Tel：0877-2664912，Email：slimytomcom收稿日期：2006_02_22。修回日期：2006_09m5万方数据微生物学通报 2006年33(6)烟草黑胫病(鼢yop琥or0 n如优ion口e Brada de Hann)，是烟草生产中一类毁灭性真菌病害。湿度大时病部长满白色菌丝，幼苗成片死亡。茎秆染病，茎基部初呈水渍状黑斑，后向上下及髓部扩散，一旦绕茎一周，植株即萎蔫死亡。病菌以厚垣孢子和菌丝体翌年又侵染烟株。该菌喜高温高湿，降雨及田间土壤湿度是黑胫病流行的关键性因素。目前的防治方法主要有选种抗
9、病品种、与禾本科作物及甘薯轮作3年以上或水旱轮作、推广高垄栽培与药剂防治。微生物防治与化学防治相结合的方法是防治植物病害有效方法，既可减少农药污染，又可解决生物防治作用缓慢的弊端12 J。木霉(nic如如mo spp)作为重要的植病生防因子一直受到普遍关注，对多种植物病原真菌表现出强拮抗作用。目前哈茨木霉(mc幻如r，九。陀i口凡Mm)是木霉属中应用较多的一个种J。本文探究哈茨木霉TH一1菌株H1的培养条件优化并用以抑制烟草疫霉的生长，为其在生防的应用提供依据。1材料与方法1-1材料木霉菌株TH一1(z口趔口n啪)经云南省烟科所分离筛选并保存。烟草疫霉菌(Pnico如几伽)由山东农业大学植保系
10、烟草教研室提供。供试培养基：PDA培养基、麦芽糖培养基“o、查氏培养基M o和琼脂培养基。12培养条件对哈茨木霉菌丝生长和产孢的影响121 培养基：用打孔器从培养好的木霉菌落(PDA平板)上切取直径为4mm的TH一1菌丝片，分别移接至PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基平板中央，25恒温培养。分别于36h测定菌落直径，4d用血球计数板测定产孢子量。每处理设4个重复。122温度：用打孔器从培养好的木霉菌落(PDA平板)上切取直径为4mm的THl菌丝片，分别移接至PDA平板中央，分别于4o、10o、15o、20OcC、25o、275、30O、325、350、38O恒温培养，36h检测
11、菌落直径，4d用血球计数板测定产孢子量。每处理4次重复。123酸碱度：用灭菌的1moLL的HCl和Na0H将PDA培养基的pH值分别调节为20、3o、4o、5o、60、70、8o、90、100，分别倒碟，接入直径4mm的TH一1菌丝片，置325培养，36h测定菌落直径，4d用血球计数板测定TH1产孢子量，每处理4次重复。124光照：将接种木霉菌的PDA平板分别置于自然光、12h和24h光照条件下培养。36h测定菌落直径，4d用血球计数板测定TH一1产孢子量。13 TH-1对烟草疫霉菌落生长与孢子萌发的影响131 TH1对烟草疫霉菌落生长的影响：用对峙培养法将木霉与烟草疫霉点接于相对的PDA平板
12、边缘，28恒温培养，连续观察菌落的生长情况。设不接种木霉只接疫霉菌培养作对照，每处理设3个重复。132 TH一1对烟草疫霉孢子萌发的影响：木霉菌无菌滤液的制备：于盛有40mL PD培养液的三角瓶中，移接TH1，室温下摇床150rmin培养。5d后真空抽滤。滤液再经万方数据2006年33(6) 微生物学通报022斗m滤器过滤，用PDA平板培养证明无菌后置4冰箱冷藏备用。于清洁的无菌凹面载玻片的凹陷穴中，滴加o2o5mL的木霉菌培养过滤液，室温下晾干后加入等量烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液，游动孢子液浓度为5103个孢子mL灭菌水或营养液，28光照培养箱培养，24h后检查游动孢子萌发情况及芽管长度。用
13、灭菌水代替木霉培养过滤液作对照。设不接种木霉只接疫霉菌培养作对照，每处理设3次重复旧J。14水解酶活性测定(平板活性检测)B一1，3葡聚糖酶活性测定：参照文献7的方法。纤维素酶活性测定：配制纤维素培养基：硫酸铵1 g，磷酸氢二钾79，磷酸二氢钾39，柠檬酸钠O59，硫酸镁019，纤维素59，琼脂15209，蒸馏水定容至1，000mL。灭菌后制平板，接种木霉菌，28恒温培养34d，加入碘氯化锌试剂，观察透明圈的有无及大小。15抗生素测定挥发性抑菌物检测：于直径9cm的培养皿皿底加入1015mL燕麦培养基待凝成平板，皿盖中心加入56mL PDA待凝成薄层。于皿盖中心接种木霉菌的05cm直径圆片，皿
14、底中心接种同样大小的烟草疫霉菌片，28恒温培养。另设不接木霉菌作对照。一周后检查黑胫病菌菌落的扩展情况，测定菌盘直径，按下列公式计算抑菌率：抑菌率()=(对照菌落扩展直径一处理菌落扩展直径)对照菌落扩展直径100。2结果与分析21 培养条件对烟草疫霉菌丝生长和产孢的影响211培养基：培养基对菌丝生长与产孢影响见表l。表1培养基对TH-l菌丝生长与产孢量影响注：表中大写字母不各处理I可P001水平上差异显著性，小写字母不P005水平上差异极显著性TH1菌株在4种培养基上菌丝生长和产孢情况，方差分析结果表明TH1菌株在4种培养基上均可生长，但PDA培养基与查氏培养基更有利于木霉菌丝生长。PDA培养
15、基上培养菌丝生长最好，产孢量也最大(表1)。212温度：PDA培养基培养，TH1在4o38O温度范围内正常生长，4O一150生长缓慢，15o275菌丝生长迅速，275cC325菌丝生长趋于平稳，325下培养平均菌落直径最大，菌丝生长最快，高于350生长量迅速下降，故在PDA培养基上，菌丝生长适宜温度为275325，最适温度325；TH1在4o15o不产孢，150c|C一275产孢量随温度升高急剧增加，275时产孢量最高，高于该温度产孢量下降，故275为产孢最适温度(图1)。213酸碱度：pH值为39范围TH-1菌丝均能正常生长和产孢，菌丝生长的适宜万方数据微生物学通报40 10 O l 5 O
16、 20 0 25 O 27 5 30 0 32 5 35 O 38 0培养温度似)2006年33(6)图1 温度对TH1菌株菌丝生长与产孢量的影响+平均菌落直径(cm)，一平均产孢量(108cflLmL)pH值为37，产孢pH值适宜范围为59，生长与产孢最适pH值为5(图2)。214光照：光照对TV一1菌株的菌丝生长影响不大，较大程度地影响其产孢量，光照时间长产孢量大(图3)。删黑扎胛趔捌犍粗2 3 4 5 6 ， 8 9 10醐值图2 pH对THl菌丝生长与产孢量的影响 图3 光照对THl菌丝生长与产孢的影响+平均菌落直径(cm)， 蠹蒌菌落直径(cm)，疆产孢量(108cflmL)+平均产
17、孢量(108cfllmL)22 TH-1对烟草疫霉菌落生长与孢子萌发的影响221 THl对烟草疫霉菌落生长的影响：TH1与烟草疫霉在PDA培养基上对峙培养4d后，木霉菌菌落直径8ocm，烟草疫霉平均菌落直径达12cm，而只接种疫霉菌的对照平均菌落直径为22cm，说明木霉菌具有良好的营养竞争能力，对疫霉菌的生长具有抑制作用。在适合疫霉菌生长的燕麦培养基上，TH1与烟草疫霉对峙培养4d后，木霉菌菌落直径66cm，烟草疫霉平均菌落直径达32cm，而只接种疫霉菌的对照平均菌落直径为6ocm，由此说明TV一1对疫霉菌菌落的生长具有明显抑制作用。222 TH1对烟草疫霉孢子萌发的影响：游动孢子萌发试验结果
18、表明，对照中芽管平均长度为282斗m，而木霉菌TH-1无菌滤液处理的游动孢子芽管平均长度为104斗m，相对抑制率平均为631，明显抑制烟草疫霉菌游动孢子芽管的伸长。对照中游动孢子平均萌发率71，而TH1无菌滤液处理游动孢子平均萌发率为62，相对抑制率平均为127，这充分说明TH一1菌株对烟草疫霉游动孢子萌发的抑制主要表现为降低游动孢子的萌发率并抑制游动孢子芽管的伸长。987654321O漂仪盯半州鞭恒万方数据2006年33(6) 微生物学通报23水解酶活性的测定p-l，3葡聚糖酶的活性测定：TH1的菌落已长满全皿，透明圈直径为5ocm，对照无透明圈。说明该菌株在平板培养过程中均产生B1，3葡聚
19、糖酶消解烟草疫霉菌的细胞壁。纤维素酶活性测定：TH1在菌落周围皆形成透明圈，菌落直径15cm，透明圈直径35cm，对照无透明圈，说明在平板培养中，TH1纤维素酶的活性较高，可产生纤维素酶参与烟草疫霉细胞壁的消解。24抗生素测定对照疫霉菌长满整个平皿，菌落直径9cm，接种有TV1菌株的疫霉菌基本长满平皿，但菌落生长不均匀，4周个别地方菌丝较少，菌落直径87cm，抑制率33，菌丝层薄而稀疏。可能TV1产生挥发性抗生素抑制黑胫病菌的生长，但对黑胫病菌菌落的扩展影响不大。3讨论(1)木霉菌能够防治多种作物上多种病害。不同种类的木霉菌其生物学特性及对病原菌的抑菌机理差异很大。木霉的其它研究工作离不开木霉
20、的培养，对特定的具有良好生防潜力的菌株进行生物学特性的研究可以了解该菌的最适培养条件，为木霉的更深入研究奠定良好的基础。本研究结果说明TV1菌株菌丝生长最适温度325，产孢最适温度275，pH 39范围TH-1菌丝均能正常生长和产孢，菌丝生长适宜pH37，产孢pH适宜范围为59，生长与产孢最适pH为5，与纪明山汐。绿色木霉的研究结果不同。光照时间长产孢量大与李雪玲叫的研究结果相吻合。(2)某些木霉种具有很强的产生纤维素酶及其它水解酶的能力，而被用于商业化生产1|，木霉还可以通过抗生作用、重寄生作用、诱导抗性等机制防治多种作物病害J。本研究就哈茨木霉菌株对烟草疫霉的抑制机理进行了初步研究，为木霉
21、抗生素与水解酶在生物防治上的应用提供了理论依据。参考文献1朱贤朝，王彦亭，王智法中国烟草病害北京：中国农业出版社，20022cook R J，Baker K FThe Natu地and Practice of Bi010垂eal contr01 of P1ant PalhogensMimlesota：American phytopathological Society StPaul Press，19833鲁素云植物病害生物防治学北京：农业大学出版社，19934李梅云，王革，李天飞，等西南农业大学学报，2001，23(1)：9125高克祥，项存悌东北林业大学学报，1995，23(2)：33396
22、方中达植病研究方法北京：中国农业出版社，19987杨合同，唐文华河南农业大学学报，1997，2：53558刘大群，田世民，肖 昆，等河北农业大学学报，1997，20(3)：15209纪明山，李博强，许远，等沈阳农业大学学报，2004，35(3)：19519910李雪玲，刘慧，张天宇山东农业大学学报(自然科学版)，2003，34(1)：5811vinzant T B，Adney w sDecker s R，耐盘zAppljed Biochemjstry and Bjotechno】ogy，2001，9193：99107万方数据哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究作者： 李梅云， 谭丽华，
23、方敦煌， 李天飞， 王革， 刘开启， LI Mei-Yun， TAN Li-Hua，FANG Dun-Huang， LI Tian-Fei， WANG Ge， LIU Kai-Qi作者单位： 李梅云,方敦煌,LI Mei-Yun,FANG Dun-Huang(云南省烟草科学研究所,玉溪,653100)， 谭丽华,TAN Li-Hua(鲁南制药股份有限公司,临沂,276003)， 李天飞,王革,LI Tian-Fei,WANGGe(玉溪红塔集团,玉溪,653100)， 刘开启,LIU Kai-Qi(仲凯农业技术学院资源环境系,广州,510225)刊名： 微生物学通报英文刊名： MICROBIOL
24、OGY年，卷(期)： 2006,33(6)被引用次数： 3次参考文献(11条)1.朱贤朝;王彦亭;王智法 中国烟草病害 20022.Cook R J;Baker K F The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens 19833.鲁素云 植物病害生物防治学 19934.李梅云;王革;李天飞 烟草主要真菌病害生防木霉的筛选期刊论文-西南农业大学学报(自然科学版) 2001(01)5.高克祥;项存悌 查看详情期刊论文-东北林业大学学报 1995(02)6.方中达 植病研究方法 19987.杨合同;唐文华 查看详情 1
25、997(02)8.刘大群;田世民;肖昆 查看详情 1997(03)9.纪明山;李博强;许远 绿色木霉TR-8菌株的生物学特性研究期刊论文-沈阳农业大学学报 2004(03)10.李雪玲;刘慧;张天宇 三株木霉生防菌的生物学特性研究期刊论文-山东农业大学学报(自然科学版) 2003(01)11.Vinzant T B;Adney W S;Decker S R 查看详情外文期刊 2001本文读者也读过(10条)1. 辛雅芬.宋天巧.高克祥.Kurt Mendgen.米士伟.刘畅.何邦令.XIN Ya-fen.SONG Tian-qiao.GAO Ke-xiang.KurtMendgen.MI Sh
26、i-wei.LIU Chang.HE Bang-ling 芦苇内生真菌M1W1C6菌株的生物学特性研究期刊论文-山东农业科学2011(3)2. 梁张慧.周而勋.谢映忠.张维民 番茄晚疫病菌的分离技术期刊论文-广西园艺2002(6)3. 王芊 木霉菌BTW41孢子萌发的条件研究期刊论文-黑龙江农业科学2002(5)4. 陈洪仪.杨楠.CHEN Hong-Yi.YANG Nan 各种营养物质对洛巴伊口蘑菌丝体生长的影响期刊论文-现代食品科技2009,25(7)5. 曹月青.殷幼平.董亚敏.何正波.CAO Yue-Qing.YIN You-Ping.DONG Ya-Min.HE Zheng-Bo 桑
27、粒肩天牛肠道纤维素分解细菌的分离和鉴定期刊论文-微生物学通报2001(1)6. 方羽生.陈艺华.杨卫华.张洪玲.赵军.卓侃 华南地区17个农作物病原真菌菌株间拮抗作用的初步研究期刊论文-云南农业大学学报2002,17(4)7. 管斌.曲音波.高培基.孙艳玲 纤维素酶酶系对草浆改性的研究期刊论文-中国造纸学报2001,16(2)8. 杜娟.曲音波.林觐勤.徐惠娟.邬小兵.龙敏南.DU Juan.QU Yin-bo.LIN Jin-qin.XU Hui-juan.WU Xiao-bing.LONG Min-nan 灰绿曲霉高产纤维素酶突变株的选育期刊论文-厦门大学学报（自然科学版）2006,45(
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