1、免疫组化（SP 法）第一天 (5h)准备：60 烘片 2-4h1. 二甲苯脱蜡 1 30min2. 二甲苯脱蜡 2 30min3. 100% 乙醇 10min 2 次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH20 1min 2 次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用 1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和 41ml 柠檬酸钠（0.1M）加 450ml ddH20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸 20min（可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至 420多，煮沸后调到 250左右，计时 15-20min）
2、之后自然冷却（30-40） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH20 加 0.18g 柠檬酸。可以直接称取 0.18g柠檬酸加 41ml 柠檬酸钠加 450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法： 29.41g 柠檬酸钠加入 1L 蒸馏水中，或 14.7g 加入 500ml 蒸馏水中9. 3%H202 孵育 10min（200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释 30%H202 至 3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与 HRP 反应，造成假阳性） ，PBS 冲洗 3min 3次经过多聚甲醛固定的组织蛋白多肽会发生交联，导致部分抗原表位封闭，因此需要进行抗原修复。抗原修复方法有以下几种
3、：1. 微波炉加热法。2. 热修复法（本实验采用） 。3. 高压热修复法。4. 酶消化法免疫组化有很多种方法，SP 法是其中一种HRP 是辣根过氧化物酶，先与底物 H202 反应，再与 DAB 反应生成不溶于水及有机溶剂的棕色颗粒10. 加试剂 A（山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育 10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂 A,B,C 放在 1 号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时 10min，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4 过夜，25-50ul 每个组织，一抗用 PBS 稀释， 4放置
4、，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天 (3h)12. PBS 3min 3 次（将 1xPBS 倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13. 加试剂 B（黄色）室温孵育 10-15min，盖盖（试剂 B 是生物素化的二抗，能与一抗结合）14. PBS 3min 3 次15. 加试剂 C（橙黄色）室温孵育 10-15min，盖盖（试剂 C 是 HRP 标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。因此试剂 C 与试剂 B 会结合）16. PBS 3min 3 次，置于 ddH20 中17. DAB 避光显色，显色后置于 ddH20 中（准备一个
5、小烧杯，装有 ddH20，DAB 显色后在烧杯中洗下）DAB 的配法：1. 关灯 2. 取 1 号冰箱里的 DAB 3. 取棕色 EP 管，12 张片子约用 1mlDAB，每张片子需 3-4 滴 4. 1ml DAB 加一滴 DAB （剧毒） ，配好后避光放置18. 苏木精 1min 左右（苏木精伊红避光，苏木精配好后需要用纱布过滤）19. 流水冲洗 2min20. 盐酸酒精分化 2-3s（快速涮两下）21. 流水冲洗反蓝 20min22. 75% 乙醇 4min85% 乙醇 4min95% 乙醇 4min100% 乙醇 4min23. 二甲苯 1 10min24. 二甲苯 2 10min25. 封片，鼠房抽屉里有中性树胶，长枪头沾取滴 1-2 滴（长盖玻片滴 4 滴）拿出片子，擦去背面多余的二甲苯，二甲苯易挥发，与中性树胶可溶，在组织旁滴上中性树胶后，立刻盖上准备好的盖玻片，放置通风处过夜晾干
