1、1 仪器设备（1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；（2）水浴锅2 试剂（1）PBS 缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。（2）0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。（3）0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）：700ml 水中溶解 186.1gEDTA2H2O，用 10 mmol/L NaOH调至 pH8.0,加水至 1000ml。（4）1mol/L 的 TBS缓冲液（pH8.0）：在
2、800ml水中溶解 121gTris碱，用 1N的 HCl调至pH8.0,加水至 1000ml。（5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N的 HCl配制。（6）3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2和 80%甲醇溶液配制。（7）封裱剂：a 甘油和 0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合；b 油和 TBS（或 PBS）配制。（8）TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4 适合于光学显微镜标本。3 操作流程（1）脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置 60
3、分钟或 60恒温箱中烘烤 20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡 10分钟，更换二甲苯后再浸泡 10分钟；2）无水乙醇中浸泡 5分钟；3）95%乙醇中浸泡 5分钟；4）70%乙醇中浸泡 5分钟；（2）抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。2）煮沸热修复电炉或者
4、水浴锅加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至 95左右，放入组织芯片加热1015分钟。3）微波热修复在微波炉里加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510分钟，反复 1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。4）酶消化方法常
5、用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37，切片也预热至 37，消化时间约为 530分钟；胃蛋白酶消化 37时间为 30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN 等。（3）免疫组织化学染色免 疫 组 化 ( 三 步 法 ) 操 作 步 骤 ： （ 1 ） 、 石 蜡 切 片 脱 蜡 至 水 。 （ 2 ） 、 3%H 2 O 2 室 温 孵 育 5-10 分 钟 ， 以 消 除 内 源 性 过 氧 化 物酶 的 活 性 。 （ 3 ） 、 蒸 馏 水 冲 洗 ， PB
6、S 浸 泡 5 分 钟 x2 （ 如 需 抗 原 修 复 ， 可 在此 步 后 进 行 ） 。 （ 4 ） 、 5-10% 正 常 山 羊 血 清 （ PBS 稀 释 ） 封 闭 ， 室 温 孵 育 10 分 钟 ， 倾 去 血 清 ， 勿 洗 。 滴 加 一 抗 工 作 液 ， 37 孵 育 1-2 小 时 或 4 过 夜 。 （ 5 ） 、 PBS 冲 洗 ， 5 分 钟 x3 次 。 （ 6 ） 、 滴 加 适 量 生 物 素 标 记 二 抗 工 作 液 ， 37 孵 育 10-30 分 钟 。 （ 7 ） 、 PBS 冲 洗 ， 5 分 钟 x3 次 。 （ 8 ） 、 滴 加 适 量
7、 的 辣 根 酶 或 碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 链 霉 卵 白 素 工 作液 ， 37 孵 育 10-30 分 钟 。 （ 9 ） 、 PBS 冲 洗 ， 5 分 钟 x3 次 。 （ 10 ） 、 显 色 剂 显 色 3-15 分 钟 （ DAB 或 NBT/BCIP ） （ 11 ） 、 自 来 水 充 分 冲 洗 ， 复 染 ， 脱 水 ， 透 明 ， 封 片 。 免 疫 组 化实 验 结 果 的 判 定 和 分 析从 实 验 结 果 而 言 ， 免 疫 组 化 技 术 服 务 主 要 涉 及 抗 体 实 验 结 果 的 描 述 与 分析 ， 图 片 的 确 定 与 选 取 ， 相
8、 关 数 据 的 提 供 ， 上 述 工 作 是 免 疫 组 化 工 作 的 重 点内 容 ， 只 有 严 格 的 实 验 设 计 ， 标 准 的 实 验 操 作 ， 专 业 化 的 结 果 分 析 才 能 更 好的 满 足 客 户 的 要 求 ， 这 点 对 于 形 式 为 腹 水 ， 上 清 ， 培 养 液 之 类 的 抗 体 显 得 更为 重 要 。 关 于 上 述 服 务 内 容 应 该 在 实 验 开 始 前 由 双 方 明 确 ， 一 般 而 言 ， 客 户方 实 验 前 应 提 出 需 要 什 么 样 的 结 果 与 分 析 ， 例 如 是 简 要 还 是 详 细 的 描 述 实
9、 验结 果 ， 需 要 实 验 数 据 否 ， 图 片 的 数 量 与 规 格 等 。 如 果 为 双 盲 试 验 或 有 第 三 方参 与 ， 则 事 先 申 明 。 编 辑 本 段免 疫 组 化 在 临 床 工 作 的 意 义近 年 来 ， 随 着 免 疫 组 织 化 学 技 术 的 发 展 和 各 种 特 异 性 抗 体 的 出 现 ， 使 许 多 疑难 肿 瘤 得 到 了 明 确 诊 断 。 在 常 规 肿 瘤 病 理 诊 断 中 ， 5%-10%的 病 例 单 靠 H.E.染 色 难 以 作 出 明 确 的 形 态 学 诊 断 。 尤 其 是 免 疫 组 化 在 肿 瘤 诊 断 和
10、鉴 别 诊 断 中的 实 用 价 值 受 到 了 普 遍 的 认 可 ， 其 在 低 分 化 或 未 分 化 肿 瘤 的 鉴 别 诊 断 时 ， 准确 率 可 达 50%-75%。 免 疫 组 织 化 学 的 临 床 应 用 主 要 包 括 以 下 几 方 面 ： (1)恶 性 肿 瘤 的 诊 断 与 鉴 别 诊 断 ； (2)确 定 转 移 性 恶 性 肿 瘤 的 原 发 部 位 ； (3)对 某 类 肿 瘤 进 行 进 一 步 的 病 理 分 型 ； （ 4） 软 组 织 肿 瘤 的 治 疗 一 般 需 根 据 正 确 的 组 织 学 分 类 ， 因 其 种 类 多 、组 织 形 态 相 像 ， 有 时 难 以 区 分 其 组 织 来 源 ， 应 用 多 种 标 志 进 行 免 疫 组 化 研 究对 软 组 织 肿 瘤 的 诊 断 是 不 可 缺 少 的 ； （ 5） 发 现 微 小 转 移 灶 ， 有 助 于 临 床 治 疗 方 案 的 确 定 ， 包 括 手 术 范 围 的确 定 。 （ 6） 为 临 床 提 供 治 疗 方 案 的 选 择 。
