1、威斯腾生物 400-675-6758TUNEL 联合免疫组化的实验步骤一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)1、常规程序制备石蜡组织块和 5 wm 厚石蜡组织切片。2、然后按照 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行 TUNEL 染色。对于石蜡切片： a. 二甲苯中脱蜡 5-10 分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡 5-10 分钟。无水乙醇 5 分钟。90%乙醇 2 分钟。70%乙醇 2 分钟，蒸馏水 2 分钟。 b. 滴加 20g/ml 不含 DNase 的蛋白酶 K，20-37 作用 15-30 分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。 c. 用 PBS 或 HB
2、SS 洗涤 3 次。注意：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 d. 在用 PBS 配制的 3%过氧化氢溶液(3% H2O2 in PBS)中室温孵育 10 分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用 PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。注：请勿在用 PBS 配制的 3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的 DNA 断裂，从而产生假阳性。e. 配制生物素标记液： 参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。 f. 样品的生物素标记： 1. 在样品上加 50l 生物素标记液， 37孵育 60 分钟。注
3、意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。 2. 用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，滴加 0.1-0.3ml 标记反应终止液，室温孵育 10 分钟。 3. 用 PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。 g. Streptavidin-HRP 工作液和 DAB 显色液的配制： a. Streptavidin-HRP 工作液的配制： 参考下表配制适量的 Streptavidin-HRP 工作液，需充分混匀。注意：配制好的 Streptavidin-HRP 工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。 威斯腾生物 400-675-6758h. DAB 显色液的配制：
4、按照每个样品使用 0.2-0.5ml 显色液的比例配制适量 DAB 显色液。等体积混合适量 DAB显色液 A 和 DAB 显色液 B，充分混匀后即为 DAB 显色液。注意：配制好的 DAB 显色液必须一次使用完毕，不宜冻存。 i. 样品的 DAB 显色： (1) 在样品上加 50l Streptavidin-HRP 工作液，室温孵育 30 分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少 Streptavidin-HRP 工作液的蒸发。 (2) 用 PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。 (3) 滴加 0.2-0.5mlDAB 显色液，室温孵育 5-30 分钟或根据显色情况
5、孵育适当时间。注：如果显色很强可以短于 5 分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。 (4) 用 PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。 (5) 选做(本步骤可不做 )：用苏木素染色液(C0107) 或甲基绿染色液(C0115) 进行细胞核染色。随后用 PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。 (6) 直接进行观察，或用 95%乙醇脱水 5 分钟，再用 100%乙醇脱水 2 次，每次约 3 分钟，再用甲苯透明 2 次，每次 5 分钟，随后封片观察。染色结果可参考下图：3、TUN EL 显色完毕后，切片人 o. O5%Tween-20 的 PBS 缓冲液中，置千加温摇床上洗
6、3遍，浸泡于 PBS 中 10 min,然后进行免疫组织化学染色。4、510正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育 12 小时或 4过夜。5、 PBS 冲洗，5 分钟3 次。6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释） ，37孵育 1030 分钟；或威斯腾生物 400-675-6758滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育 1030 分钟。7、 PBS 冲洗，5 分钟3 次。8、 显色剂显色（DAB 或 AEC） 。荧光 TUNEL 联合免疫荧光的实验步骤TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(
7、显色法)1、常规程序制备石蜡组织块和 5 wm 厚石蜡组织切片。2、然后按照 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行 TUNEL 染色。对于石蜡切片：a. 二甲苯中脱蜡 5-10 分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡 5-10 分钟。无水乙醇 5 分钟。90%乙醇 2 分钟。70%乙醇 2 分钟，蒸馏水 2 分钟。b. 滴加 20 g/ml 不含 DNase 的蛋白酶 K，20-37作用 15-30 分钟( 不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。c. PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。注意：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。3、 配制 TUNEL 检测液
8、：参考下表配制适当量的 TUNEL 检测液，需充分混匀。注意：配制好的 TUNEL 检测液必须一次使用完毕，不能冻存。a. 用 PBS 或 HBSS 洗涤 2 次。b. 在样品上加 50l TUNEL 检测液，37避光孵育 60 分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少 TUNEL 检测液的蒸发。c. PBS 或 HBSS 洗涤 3 次。d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。Cy3 的激发波长为 550nm，发射波长为570nm (红色荧光)。4、PBS（0.01M）浸洗 3 次，每次 3min。5、0.5%Triton X-100( PBS 配制 )室
9、温通透 20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤） ； 6、PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温（6%山羊血清，PBS 配置）封闭 30min。 威斯腾生物 400-675-67587、 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗，并放入湿盒，4孵育过夜； 8、37 度复温 45min，加荧光二抗（PBS 配置） 。 PBS 浸洗爬片 3 次，每次 3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37孵育 1h，PBS 浸洗切片 3次，每次 3min； 注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。 二抗一定要用蓝色荧光的，因为 TUNEL 为红色荧光，慢病毒 GFP 为绿色荧光。9、复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5min，对标本进行染核，PBS 5min4 次洗去多余的DAPI； 10、用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
