1、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂 1）PBS 缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（CB ，pH6.0，1000ml ）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）：700ml 水中溶解 186.1gEDTA2H2O，用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。4）1mol/L 的 TBS 缓冲
2、液（pH8.0）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至 pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1% 胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4% 胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCl 配制。6）3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合； b、油和 TBS(或 PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本； pH7.07.4 适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程 1、
3、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60恒温箱中烘烤 20 分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟；2）无水乙醇中浸泡 5 分钟；3）95%乙醇中浸泡 5 分钟； 4）70%乙醇中浸泡 5 分钟； 2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复 在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中
4、，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至 95左右，放入组织芯片加热 1015 分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 510 分钟，反复 1-2 次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin， ER，Heat shock protein，HPV， Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p1
5、5，P-glycoprotein，PKC，PR ，PCNA，ras，Rb ，Topoismerase 等。 2）酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37，切片也预热至 37，消化时间约为 530 分钟；胃蛋白酶消化 37时间为 30 分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN 等。3、免疫组织化学染色 SP 法1）脱蜡、水化；2）PBS 洗 23 次各 5 分钟；3）3%H2O2（80% 甲醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；4）PBS 洗 2
6、3 次各 5 分钟； 5）抗原修复；6）PBS 洗 23 次各 5 分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。8）滴加抗 50l，室温静置 1 小时或者 4过夜或者 371 小时。9）4过夜后需在 37复温 45 分钟。10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；11）滴加抗 4050l ，室温静置，或 371 小时；12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）PBS 洗 3 次各 5 分钟；14）DAB 显色 510 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS 或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 1015
7、分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC 法1)脱蜡、水化。2)PBS 洗两次各 5 分钟。3)用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 510 分钟，蒸馏水洗 3 次。4)抗原修复。5)PBS 洗 5 分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。7)滴加抗,室温 1 小时或者 4 过夜或者 371 小时（4过夜后在 37复温 45 分钟）。8)PBS 洗三次每次 2 分钟。9)滴加生物素化二抗,2037 20 分钟。10)PBC 洗 3 次每次 2 分钟。11)滴加试剂 SABC，203720 分钟。12)PBS 洗 4 次每次 5 分钟。13)DAB 显色：DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。 15)脱水、透明、封片、镜检。
