1、微生物专业优秀论文 猪链球菌 2 型荚膜缺失株的构建及其致病性研究关键词：猪链球菌 2 型 荚膜多糖 基因敲除 生物学性状 致病性摘要：猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南
2、京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的
3、生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与
4、突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无
5、论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cp
6、s2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。正文内容猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在
7、包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps
8、2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Sou
9、thern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功
10、获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只
11、 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击
12、小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic sho
13、ck syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS
14、与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，
15、观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与
16、上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株
17、cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病
18、的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，0
19、5ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B
20、 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；
21、电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔
22、接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.sui
23、s2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Str
24、eptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作
25、用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细
26、菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全
27、血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康
28、。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2
29、，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序
30、，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基
31、因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色
32、结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30
33、 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后
34、一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国
35、内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌
36、的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠
37、定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZY
38、H33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微
39、发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型
40、(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS6
41、8(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为
42、cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并
43、无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将
44、 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小鼠产生
45、的抗体效价大于 1：25600，完成最后一次免疫后一周，用致死剂量的 S.suis2 高致病性菌株 05ZYH33 攻击小鼠，观察对照组和免疫组小鼠的存活情况，计算存活率，统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性.结果显示突变株cps2B 能够使小鼠产生免疫保护作用，提示其可以作为疫苗候选分子。猪链球菌 2 型(Streptococcus suis2，S.suis2)是一种重要的人畜共患病的病原体。迄今为止，S.suis2 已在包括欧美、澳大利亚和中国在内的 20 多个国家和地区引发了人感染的病例。尤为值得关注的是，我国的江苏和四川两省分别在 1998 和 2005 年发生两起猪链球菌
46、感染猪和人的公共卫生事件，感染者出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。本课题组(南京军区军事医学研究所)对 1998 年和 2005 年流行的强致病株 98HAH12，05ZYH33(两株均分离自 STSS 病人)及无毒株05JYS68(分离自江苏健康猪)进行了全基因组测序，并对基因组进行了注释。注释结果显示，05ZYH33 中含有荚膜合成基因 cps2B。同源比对发现，该基因编码的氨基酸序列与肺炎链球菌的荚膜多糖合成蛋白 Wzd 的氨基酸序列相似性为58。大量研究表明，荚膜多糖(capsular polys
47、accharide，CPS)是多种病原菌的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要的作用。为阐明 05ZYH33 中 CPS 与致病性的关系，我们锁定 CPS 对其进行深入的生物学功能研究，实验内容和结果主要包括以下几方面： 1、S.suis05ZYH33 cps2B 基因敲除突变株的构建：构建中间为观霉素抗性基因，两侧为 cps2B 编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒，通过同源重组筛选 cps2B 基因敲除突变体。PCR 分析和 Southern 杂交结果均显示 cps2B 基因完全被壮观霉素抗性基因替代，基因敲除突变体构建成功。筛选获得 05ZYH3 荚膜合成基因 cps2B 敲除突变体，为
48、阐明荚膜多糖在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。 2、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学性状的影响：在相同的条件下，观察 S.suis2 野生株 05ZYH33 与突变株cps2B 的基本生物学性状有无明显差异。结果发现，cps2B 编码基因敲除后，细菌能稳定生长，在琼脂血平板上，敲除株与野生株溶血活性及细菌形态并无差别。cps2B 基因敲除后，革兰染色结果发现细菌成链能力降低，细菌更为散在；电镜结果显示突变体荚膜合成能力丧失，成功获得了 05ZYH33 荚膜缺失株，cps2B 在凝集实验中不再与荚膜特异性抗血清发生凝集反应。 3、cps2B 基因缺失对细菌基本生物学功能的影响：在相同条件
49、下，观察 S.suis2 野生株05ZYH33 与突变株cps2B 在人和仔猪全血中的生存能力，同时观察野生株和突变株与上皮细胞的粘附能力，结果显示突变株cps2B 无论在人还是仔猪的全血中生存能力大为降低，更容易被全血清除，而与上皮细胞的粘附能力大为增强。 4、突变株cps2B 和野生株动物致病实验：在小鼠模型中，将 28 日龄Balb/c 品系小鼠 30 只平均分为 3 组。第 1 组通过腹腔接种猪链球菌 2 型强毒株稀释菌液，每只 Iml，约合 108CFU 细菌；第 2 组以相同方式接种该突变株cps2B 稀释菌液；第 3 组注射相同体积的 THS 作为阴性对照。野毒组小鼠在 2日内死亡 8 只，而突变组小鼠只有部分小鼠轻微发病，无死亡发生，48h 内全部恢复健康。突变株基本对小鼠丧失毒力。 5、突变株cps2B 和野生株动物保护性实验：用突变株cps2B 免疫 Balb/c 小鼠，同时设立阴性对照，收集抗血清，ELISA 检测抗血清效价。结果表明cps2B 能刺激小鼠机体产生免疫应答，免疫小
