1、海洋生物学专业毕业论文 精品论文 原位可注射壳聚糖基温敏水凝胶缓释体系的构建及其在牙周病治疗领域的应用研究关键词：原位可注射壳 牙周病 药物释放载体 壳聚糖摘要：牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵
2、抗问题的出现，使得局部药物释放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。 壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶
3、性差的缺点。 本试验中，利用CS 与醚化剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通
4、过。奥硝唑和氯已啶在人工唾液中的体外释放分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏
5、水凝胶较水凝胶基质或抗生素单纯对牙周常见致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDL
6、Cs 增殖的作用。 细胞透射电镜显示：浓度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HT
7、CC，G1细胞较对照组显著减少，S显著增多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TN
8、F- 有显著的抑制作用。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再
9、生的作用。 所有以上实验结果提示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。正文内容牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵
10、抗问题的出现，使得局部药物释放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。 壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶
11、性差的缺点。 本试验中，利用CS 与醚化剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通
12、过。奥硝唑和氯已啶在人工唾液中的体外释放分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏
13、水凝胶较水凝胶基质或抗生素单纯对牙周常见致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDL
14、Cs 增殖的作用。 细胞透射电镜显示：浓度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HT
15、CC，G1细胞较对照组显著减少，S显著增多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TN
16、F- 有显著的抑制作用。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再
17、生的作用。 所有以上实验结果提示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的
18、出现，使得局部药物释放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶性差的缺点
19、。 本试验中，利用CS 与醚化剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通过。奥硝唑
20、和氯已啶在人工唾液中的体外释放分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏水凝胶较水
21、凝胶基质或抗生素单纯对牙周常见致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDLCs 增殖
22、的作用。 细胞透射电镜显示：浓度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HTCC，G1
23、细胞较对照组显著减少，S显著增多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TNF- 有显
24、著的抑制作用。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再生的作用。
25、 所有以上实验结果提示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的出现，使得
26、局部药物释放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶性差的缺点。 本试验
27、中，利用CS 与醚化剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通过。奥硝唑和氯已啶在
28、人工唾液中的体外释放分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏水凝胶较水凝胶基质或
29、抗生素单纯对牙周常见致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDLCs 增殖的作用。
30、细胞透射电镜显示：浓度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HTCC，G1细胞较对照
31、组显著减少，S显著增多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TNF- 有显著的抑制作
32、用。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再生的作用。 所有以上
33、实验结果提示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的出现，使得局部药物释
34、放系统成为研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶性差的缺点。 本试验中，利用C
35、S 与醚化剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通过。奥硝唑和氯已啶在人工唾液中
36、的体外释放分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏水凝胶较水凝胶基质或抗生素单纯
37、对牙周常见致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDLCs 增殖的作用。 细胞透射电
38、镜显示：浓度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HTCC，G1细胞较对照组显著减少
39、，S显著增多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TNF- 有显著的抑制作用。CS/
40、HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再生的作用。 所有以上实验结果提
41、示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的出现，使得局部药物释放系统成为
42、研究的热点。具有可生物降解和原位注射温度敏感水凝胶近十年来被高度关注，被认为是最方便、最可靠且最能够满足口腔科医师需要的牙周病局部给药剂型。壳聚糖(Chitosan，CS)是天然生物多糖，大量文献报道壳聚糖无毒、无刺激性及无免疫源性；具有良好的生物相容性、生物粘附性、生物可降解性、抑菌性、促进伤口愈合、组织再生等优良特性及较好的可塑性。在生物医药领域被广泛用作药物释放载体、组织工程支架及抑菌剂等。壳聚糖季铵盐(Quaternized chitosan，HTCC)是将 CS 的氨基引入季铵基团引入 CS 分子链中而得到的一类壳聚糖衍生物，以改善 CS 水溶性差的缺点。 本试验中，利用CS 与醚化
43、剂 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)反应，制备 HTCC，合成的HTCC 取代度为 74.5。以 CS 及 HTCC 配合 ，-甘油磷酸(，-GP)制备原位可注射物理交联壳聚糖基温敏水凝胶(CS/HTCC-GP 水凝胶)，此水凝胶中无任何化学交联剂。其溶胶-凝胶的转变时间可被控制在 25以上。CS 与 HTCC 的比例、，-GP 的浓度均可控制转变温度和时间。当 CS 与 HTCC 的重量比为5/1、，-GP 的终浓度为 8.33，37时的溶胶-凝胶转变时间为 3 min。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶超微结构疏松、多孔，以利于水分子的自由通过。奥硝唑和氯已啶在人工唾液中的体外释放
44、分别超过 3 h 和 18 h，说明 CS/HTCC-GP 温敏水温敏水凝胶能够有效的延缓模型药物的体外释放率，而其中对氯已啶的缓释效果好于奥硝唑。 选用牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴防线放线杆菌 3 种牙周常见 G-厌氧致病菌株为实验菌种，采用我国卫生部和美国国家标准化组织推荐厌氧菌药敏培养方法琼脂稀释法测定 CS、HTCC 及 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对三种牙周常见菌的最低抑菌浓度和抑菌环直径。结果表明，CS 及 HTCC对三种致病菌有较强的抑制活性，HTCC 的抑菌活性较 CS 略强。WCS/WHTCC=5/1时具有最强的抑菌活性。载药温敏水凝胶较水凝胶基质或抗生素单纯对牙周常见
45、致病菌的 MIC 显著减少，抑制活性显著增强。CS-HTCC/GP 温敏水凝胶的抑菌环直径较 CS-GP 的大。 原代培养牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)，MTT 比色法实验测定 CS、HTCC 和 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对细胞增殖的影响。结果显示 CS 在浓度 0.2-2000g/mL 均对 HPDLCs 的增殖有促进作用。HTCC 在浓度为 0.2-10g/mL 能够促进 HPDLCs 的增殖，而浓度为 50-2000g/mL 时，则有抑制细胞增殖的作用。含有不同浓度 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶浸提液的培养基均有不同程度促进 HPDLCs 增殖的作用。 细胞透射电镜显示：浓
46、度为 1000g/mL 和3g/mL 的 CS 以及 3g/mL 的 HTCC 作用下的 HPDLCs 的超微结构与正常对照组无显著差别。而浓度为 1000g/mL 的 HTCC 表现出细胞溶解等严重的细胞破坏现象。含 50CS/HTCC-GP 温敏水凝胶的浸提液的 DMEM 培养的 HPDLCs 的超微结构正常，未见细胞破坏现象。 应用流式细胞仪(FCM)对 CS、HTCC 和CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对 HPDLCs 的细胞周期检测。结果表明浓度为 3g/mL和 3 mg/mL 的 CS 能使细胞的 G1增多，S减少。浓度为 3g/mL 的HTCC，G1细胞较对照组显著减少，S显著增
47、多；而浓度为 1 mg/mL 和 3 mg/mL 时均发生细胞凋亡率，凋亡率分别为 10.6和 51.8。CS/HTCC-GP 温敏水凝胶可以加速 HPLDCs 的分化与增殖。 通过 ELISA 法测定 CS、HTCC 和 CS-HTCC/GP 对 LPS 介导 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF- 的影响。CS 在最初的 48 h能够抑制 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。而 HTCC 在最初 24 h 就促进 HPDLCs 分泌 IL-1 和 TNF-。bFGF 对 LPS 介导的 HPDLCs 分泌 IL-1 和TNF- 有显著的抑制作用。CS/HTCC-
48、GP 温敏水凝胶的浸提液能够不同程度的减少 LPS 介导的 HPDLCs 对 IL-1 和 TNF- 的分泌。 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶大鼠股部肌肉内原位注射结果表明，CS/HTCC-GP 温敏水凝胶具有良好的组织相容性。毒理学实验结果表明：CS、HTCC、CS/HTCC-GP、CS/HTCC-GP-1Onz和 CS/HTCC-GP-0.1Chx 温敏水凝胶临床使用安全。 并通过建立犬牙周组织缺损病理模型，检测 CS/HTCC-GP 温敏水凝胶对牙周组织再生的作用。结果表明CS/HTCC-GP 温敏水凝胶是良好的生长因子载体，具有较强的促进组织再生的作用。 所有以上实验结果提示，CS/HTCC-GP 温度敏感水凝胶表现出良好的生物相容性和生物功能性，是牙周局部缓释药物载体和组织工程支架的理想选择。牙周病是发生在牙周支持组织的细菌感染性疾病，是一种在世界范围内广泛散播的常见病和多发病。牙周病不仅表现为牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的炎症和降解，而且被认为是其他系统性疾病的危险因子，如心血管疾病、中风和低体重早产儿。目前公认牙周病是多因素疾病，细菌菌斑及其产物是引发牙周病必需的始动因子。因此合理正确的使用抗生素治疗牙周病是必要的辅助手段，尤其对复发性和重度牙周病来讲更是不可或缺。 近年来由于全身应用抗生素的毒副作用及日益严重的细菌抵抗问题的出现，使得局部药物释放系统成为
