医学 jakstat、pka和erk信号通路对tlryou导中性粒细胞生存影响及bak蛋白表达的研究.doc

1、医学免疫学专业优秀论文 JAK/STAT、PKA 和 ERK 信号通路对 TLR诱导中性粒细胞生存影响及 Bak 蛋白表达的研究关键词：信号通路 中性粒细胞 TLR 配体 激酶抑制剂 Bak 蛋白 蛋白表达摘要：目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。T

2、LR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、丝裂原活化蛋白

3、激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）等信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通路。为进一步研究有关 TLR 诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实验将探讨 JAK/STAT（janus activated kinase/signal transducer and activator of transcription） ，PKA（protein kinase A）和ERK（extracellular signal-regu

4、lated protein kinase）通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平探索 TLR 诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不同分子调控机制，从而为 TLR 配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验室依据。此外，中性粒细胞中 Bcl-2 家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目前还很少报道有关 Bcl-2 家族对 TLR 作用于中性粒细胞功能的影响。本实验探索 TLR 配体刺激下中性粒细胞内 Bak（Bcl-2 homologous antagonistkiller）蛋白表达水平，将为调控中性

5、粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。 方法：Ficoll 密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染和 Wright-Giemsa 混和染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养 8h，利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测 TLR 对纯化中性粒细胞的凋亡抑制率；再分别加入 JAK/STAT 抑制剂 AG490、PKA 抑制剂 H-89、ERK 抑制剂U0126 和不加任何刺激物情况下培养 1h 后再与 TLR 配体共同培养 8h，构建JAK/STAT 通路，PKA 通路，ERK 通路和自发性凋亡的细胞模型。流式

6、细胞术检测、分析、对比抑制信号转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养，提取 Pam3CSK4（TLR1/2） 、PGN（TLR2） 、LPS（TLR4） 、flagellin（TLR5） 、MALP-2（TLR2/6） 、loxoribine（TLR7） 、R848（TLR7/8） 、CpG-DNA（TLR9）和空白对照组的中性粒细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，SDS-PAGE 观察各组蛋白表达差异性；使用特异性抗 Bak 多克隆抗体和内参 GAPDH 多克隆抗体通过 Western blotting 技术检测并比较 Bak 在不同的中性粒细胞药物刺激

7、模型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及 TLR 刺激 Bcl-2 家族蛋白的调节作用。 结果：1.光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均gt;96%；2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行 Annexin V 和 PI 双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过 8h 培养，其自发性凋亡的发生率为 24.35%，而中性粒细胞经 TLR 配体刺激后，凋亡率与自发性凋亡组比较有明显的差异性（Plt;0.05） 。3.流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR 诱导中性粒细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 AG490（JAK/STAT 抑制剂） ，H-

8、89（PKA 抑制剂），U0126（ERK 抑制剂）单独与中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而 AG490 能减少 PGN 依赖的凋亡抑制，但 H-89、U0126 对 PGN 诱导的中性粒细胞无凋亡抑制作用；延伸用其它 TLR 配体检测发现 H-89，U0126 对 TLR 诱导中性粒细胞生存也无影响作用，而 AG490 对 LPS、PGN、R848、MALP-2 诱导的中性粒细胞生存有相似的抑制效应。4.培养 2h 和 8h 后，将各模型组中的中性粒细胞裂解，抽提总蛋白进行 SDS-PAGE 并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下，中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同

9、程度的改变。5.TLR配体刺激中性粒细胞 0h、1h、2h、4h、8h 后，提取蛋白并用 Western blotting 技术检测比较 Bak 蛋白的表达。结果显示：与自发性凋亡组相比，LPS、PGN、flagellin、Pam3CSK4、R848、MALP-2、CpG-DNA 和 loxoribine 对中性粒细胞内 Bak 蛋白的表达量无明显作用，Bak 的表达率与 TLR 两者之间无明显的时效关系。 结论：1.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4 和 CpG-DNA在 8h 能延迟纯化中性粒细胞的自发性凋亡；而 flagellin 和 loxoribine 在 8h

10、对延迟纯化中性粒细胞凋亡是低效或无效的。2.JAK/STAT 信号通路抑制剂AG490 在 8h 能减少 LPS、PGN、R848、MALP-2 依赖的凋亡抑制，对诱导的中性粒细胞生存有抑制作用。JAK/STAT 信号转导通路可能参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞生存的信号转导途径。3.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4、CpG-DNA、flagellin 和 loxoribine 这 8 种不同的 TLR 配体对 Bak 蛋白的表达影响与 TLR 类型可能无关。Bak 可能不参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞死亡的信号转导途径。正文内容目的：中性粒细胞（polymorp

11、honuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。TLR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要

12、作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）等信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通

13、路。为进一步研究有关 TLR 诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实验将探讨 JAK/STAT（janus activated kinase/signal transducer and activator of transcription） ，PKA（protein kinase A）和ERK（extracellular signal-regulated protein kinase）通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平探索 TLR 诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不同分子调控机制，从而为 TLR 配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验室依据。

14、此外，中性粒细胞中 Bcl-2 家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目前还很少报道有关 Bcl-2 家族对 TLR 作用于中性粒细胞功能的影响。本实验探索 TLR 配体刺激下中性粒细胞内 Bak（Bcl-2 homologous antagonistkiller）蛋白表达水平，将为调控中性粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。 方法：Ficoll 密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染和 Wright-Giemsa 混和染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养 8h

15、，利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测 TLR 对纯化中性粒细胞的凋亡抑制率；再分别加入 JAK/STAT 抑制剂 AG490、PKA 抑制剂 H-89、ERK 抑制剂U0126 和不加任何刺激物情况下培养 1h 后再与 TLR 配体共同培养 8h，构建JAK/STAT 通路，PKA 通路，ERK 通路和自发性凋亡的细胞模型。流式细胞术检测、分析、对比抑制信号转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养，提取 Pam3CSK4（TLR1/2） 、PGN（TLR2） 、LPS（TLR4） 、flagellin（TLR5） 、MALP-2（TL

16、R2/6） 、loxoribine（TLR7） 、R848（TLR7/8） 、CpG-DNA（TLR9）和空白对照组的中性粒细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，SDS-PAGE 观察各组蛋白表达差异性；使用特异性抗 Bak 多克隆抗体和内参 GAPDH 多克隆抗体通过 Western blotting 技术检测并比较 Bak 在不同的中性粒细胞药物刺激模型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及 TLR 刺激 Bcl-2 家族蛋白的调节作用。 结果：1.光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均gt;96%；2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行 Annexin V 和 P

17、I 双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过 8h 培养，其自发性凋亡的发生率为 24.35%，而中性粒细胞经 TLR 配体刺激后，凋亡率与自发性凋亡组比较有明显的差异性（Plt;0.05） 。3.流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR 诱导中性粒细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 AG490（JAK/STAT 抑制剂） ，H-89（PKA 抑制剂），U0126（ERK 抑制剂）单独与中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而 AG490 能减少 PGN 依赖的凋亡抑制，但 H-89、U0126 对 PGN 诱导的中性粒细胞无凋亡抑制作用；延伸用其它 TLR 配体

18、检测发现 H-89，U0126 对 TLR 诱导中性粒细胞生存也无影响作用，而 AG490 对 LPS、PGN、R848、MALP-2 诱导的中性粒细胞生存有相似的抑制效应。4.培养 2h 和 8h 后，将各模型组中的中性粒细胞裂解，抽提总蛋白进行 SDS-PAGE 并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下，中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5.TLR配体刺激中性粒细胞 0h、1h、2h、4h、8h 后，提取蛋白并用 Western blotting 技术检测比较 Bak 蛋白的表达。结果显示：与自发性凋亡组相比，LPS、PGN、flagellin、Pam3CSK4、R8

19、48、MALP-2、CpG-DNA 和 loxoribine 对中性粒细胞内 Bak 蛋白的表达量无明显作用，Bak 的表达率与 TLR 两者之间无明显的时效关系。 结论：1.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4 和 CpG-DNA在 8h 能延迟纯化中性粒细胞的自发性凋亡；而 flagellin 和 loxoribine 在 8h对延迟纯化中性粒细胞凋亡是低效或无效的。2.JAK/STAT 信号通路抑制剂AG490 在 8h 能减少 LPS、PGN、R848、MALP-2 依赖的凋亡抑制，对诱导的中性粒细胞生存有抑制作用。JAK/STAT 信号转导通路可能参与 TLR 配

20、体诱导的中性粒细胞生存的信号转导途径。3.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4、CpG-DNA、flagellin 和 loxoribine 这 8 种不同的 TLR 配体对 Bak 蛋白的表达影响与 TLR 类型可能无关。Bak 可能不参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞死亡的信号转导途径。目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用

21、 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。TLR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞

22、的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）等信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通路。为进一步研究有关 TLR 诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实验将探讨 JAK/STAT（janus activated kinase/signal transducer and activator of transcription） ，P

23、KA（protein kinase A）和ERK（extracellular signal-regulated protein kinase）通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平探索 TLR 诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不同分子调控机制，从而为 TLR 配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验室依据。此外，中性粒细胞中 Bcl-2 家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目前还很少报道有关 Bcl-2 家族对 TLR 作用于中性粒细胞功能的影响。本实验探索 TLR 配体刺激下中性粒细胞内 B

24、ak（Bcl-2 homologous antagonistkiller）蛋白表达水平，将为调控中性粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。 方法：Ficoll 密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染和 Wright-Giemsa 混和染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养 8h，利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测 TLR 对纯化中性粒细胞的凋亡抑制率；再分别加入 JAK/STAT 抑制剂 AG490、PKA 抑制剂 H-89、ERK 抑制剂U0126 和不加任何刺激物情况下培养 1h 后再与 TLR 配

25、体共同培养 8h，构建JAK/STAT 通路，PKA 通路，ERK 通路和自发性凋亡的细胞模型。流式细胞术检测、分析、对比抑制信号转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养，提取 Pam3CSK4（TLR1/2） 、PGN（TLR2） 、LPS（TLR4） 、flagellin（TLR5） 、MALP-2（TLR2/6） 、loxoribine（TLR7） 、R848（TLR7/8） 、CpG-DNA（TLR9）和空白对照组的中性粒细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，SDS-PAGE 观察各组蛋白表达差异性；使用特异性抗 Bak 多克隆抗体和内参 GAPDH

26、多克隆抗体通过 Western blotting 技术检测并比较 Bak 在不同的中性粒细胞药物刺激模型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及 TLR 刺激 Bcl-2 家族蛋白的调节作用。 结果：1.光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均gt;96%；2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行 Annexin V 和 PI 双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过 8h 培养，其自发性凋亡的发生率为 24.35%，而中性粒细胞经 TLR 配体刺激后，凋亡率与自发性凋亡组比较有明显的差异性（Plt;0.05） 。3.流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR 诱导中性粒

27、细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 AG490（JAK/STAT 抑制剂） ，H-89（PKA 抑制剂），U0126（ERK 抑制剂）单独与中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而 AG490 能减少 PGN 依赖的凋亡抑制，但 H-89、U0126 对 PGN 诱导的中性粒细胞无凋亡抑制作用；延伸用其它 TLR 配体检测发现 H-89，U0126 对 TLR 诱导中性粒细胞生存也无影响作用，而 AG490 对 LPS、PGN、R848、MALP-2 诱导的中性粒细胞生存有相似的抑制效应。4.培养 2h 和 8h 后，将各模型组中的中性粒细胞裂解，抽提总蛋白进行 SD

28、S-PAGE 并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下，中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5.TLR配体刺激中性粒细胞 0h、1h、2h、4h、8h 后，提取蛋白并用 Western blotting 技术检测比较 Bak 蛋白的表达。结果显示：与自发性凋亡组相比，LPS、PGN、flagellin、Pam3CSK4、R848、MALP-2、CpG-DNA 和 loxoribine 对中性粒细胞内 Bak 蛋白的表达量无明显作用，Bak 的表达率与 TLR 两者之间无明显的时效关系。 结论：1.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4 和 CpG-DNA在

29、 8h 能延迟纯化中性粒细胞的自发性凋亡；而 flagellin 和 loxoribine 在 8h对延迟纯化中性粒细胞凋亡是低效或无效的。2.JAK/STAT 信号通路抑制剂AG490 在 8h 能减少 LPS、PGN、R848、MALP-2 依赖的凋亡抑制，对诱导的中性粒细胞生存有抑制作用。JAK/STAT 信号转导通路可能参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞生存的信号转导途径。3.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4、CpG-DNA、flagellin 和 loxoribine 这 8 种不同的 TLR 配体对 Bak 蛋白的表达影响与 TLR 类型可能无关。Bak 可

30、能不参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞死亡的信号转导途径。目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。TLR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecul

31、ar pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol3

32、-kinase，PI3K）等信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通路。为进一步研究有关 TLR 诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实验将探讨 JAK/STAT（janus activated kinase/signal transducer and activator of transcription） ，PKA（protein kinase A）和ERK（extracellular signal-regulated protein kinase）通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平探索 TLR 诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不

33、同分子调控机制，从而为 TLR 配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验室依据。此外，中性粒细胞中 Bcl-2 家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目前还很少报道有关 Bcl-2 家族对 TLR 作用于中性粒细胞功能的影响。本实验探索 TLR 配体刺激下中性粒细胞内 Bak（Bcl-2 homologous antagonistkiller）蛋白表达水平，将为调控中性粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。 方法：Ficoll 密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染和 Wright-Giemsa 混和

34、染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养 8h，利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测 TLR 对纯化中性粒细胞的凋亡抑制率；再分别加入 JAK/STAT 抑制剂 AG490、PKA 抑制剂 H-89、ERK 抑制剂U0126 和不加任何刺激物情况下培养 1h 后再与 TLR 配体共同培养 8h，构建JAK/STAT 通路，PKA 通路，ERK 通路和自发性凋亡的细胞模型。流式细胞术检测、分析、对比抑制信号转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养，提取 Pam3CSK4（TLR1/2） 、PG

35、N（TLR2） 、LPS（TLR4） 、flagellin（TLR5） 、MALP-2（TLR2/6） 、loxoribine（TLR7） 、R848（TLR7/8） 、CpG-DNA（TLR9）和空白对照组的中性粒细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，SDS-PAGE 观察各组蛋白表达差异性；使用特异性抗 Bak 多克隆抗体和内参 GAPDH 多克隆抗体通过 Western blotting 技术检测并比较 Bak 在不同的中性粒细胞药物刺激模型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及 TLR 刺激 Bcl-2 家族蛋白的调节作用。 结果：1.光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均gt;

36、96%；2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行 Annexin V 和 PI 双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过 8h 培养，其自发性凋亡的发生率为 24.35%，而中性粒细胞经 TLR 配体刺激后，凋亡率与自发性凋亡组比较有明显的差异性（Plt;0.05） 。3.流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR 诱导中性粒细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 AG490（JAK/STAT 抑制剂） ，H-89（PKA 抑制剂），U0126（ERK 抑制剂）单独与中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而 AG490 能减少 PGN 依赖的凋亡抑制，但

37、 H-89、U0126 对 PGN 诱导的中性粒细胞无凋亡抑制作用；延伸用其它 TLR 配体检测发现 H-89，U0126 对 TLR 诱导中性粒细胞生存也无影响作用，而 AG490 对 LPS、PGN、R848、MALP-2 诱导的中性粒细胞生存有相似的抑制效应。4.培养 2h 和 8h 后，将各模型组中的中性粒细胞裂解，抽提总蛋白进行 SDS-PAGE 并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下，中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5.TLR配体刺激中性粒细胞 0h、1h、2h、4h、8h 后，提取蛋白并用 Western blotting 技术检测比较 Bak 蛋白的表

38、达。结果显示：与自发性凋亡组相比，LPS、PGN、flagellin、Pam3CSK4、R848、MALP-2、CpG-DNA 和 loxoribine 对中性粒细胞内 Bak 蛋白的表达量无明显作用，Bak 的表达率与 TLR 两者之间无明显的时效关系。 结论：1.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4 和 CpG-DNA在 8h 能延迟纯化中性粒细胞的自发性凋亡；而 flagellin 和 loxoribine 在 8h对延迟纯化中性粒细胞凋亡是低效或无效的。2.JAK/STAT 信号通路抑制剂AG490 在 8h 能减少 LPS、PGN、R848、MALP-2 依赖的凋

39、亡抑制，对诱导的中性粒细胞生存有抑制作用。JAK/STAT 信号转导通路可能参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞生存的信号转导途径。3.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4、CpG-DNA、flagellin 和 loxoribine 这 8 种不同的 TLR 配体对 Bak 蛋白的表达影响与 TLR 类型可能无关。Bak 可能不参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞死亡的信号转导途径。目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和

40、维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。TLR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着

41、关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）等信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通路。为进一步研究有关 TLR 诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实验将探讨 JAK/STAT（janus activated kinase/signal

42、 transducer and activator of transcription） ，PKA（protein kinase A）和ERK（extracellular signal-regulated protein kinase）通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平探索 TLR 诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不同分子调控机制，从而为 TLR 配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验室依据。此外，中性粒细胞中 Bcl-2 家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目前还很少报道有关 Bcl-2

43、 家族对 TLR 作用于中性粒细胞功能的影响。本实验探索 TLR 配体刺激下中性粒细胞内 Bak（Bcl-2 homologous antagonistkiller）蛋白表达水平，将为调控中性粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。 方法：Ficoll 密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染和 Wright-Giemsa 混和染色后用光镜检测新鲜分离的中性粒细胞的活性和纯度。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养 8h，利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测 TLR 对纯化中性粒细胞的凋亡抑制率；再分别加入 JAK/STAT 抑制剂 AG490、PKA 抑制

44、剂 H-89、ERK 抑制剂U0126 和不加任何刺激物情况下培养 1h 后再与 TLR 配体共同培养 8h，构建JAK/STAT 通路，PKA 通路，ERK 通路和自发性凋亡的细胞模型。流式细胞术检测、分析、对比抑制信号转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与 TLR 配体共同培养，提取 Pam3CSK4（TLR1/2） 、PGN（TLR2） 、LPS（TLR4） 、flagellin（TLR5） 、MALP-2（TLR2/6） 、loxoribine（TLR7） 、R848（TLR7/8） 、CpG-DNA（TLR9）和空白对照组的中性粒细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，S

45、DS-PAGE 观察各组蛋白表达差异性；使用特异性抗 Bak 多克隆抗体和内参 GAPDH 多克隆抗体通过 Western blotting 技术检测并比较 Bak 在不同的中性粒细胞药物刺激模型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及 TLR 刺激 Bcl-2 家族蛋白的调节作用。 结果：1.光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均gt;96%；2.运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行 Annexin V 和 PI 双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过 8h 培养，其自发性凋亡的发生率为 24.35%，而中性粒细胞经 TLR 配体刺激后，凋亡率与自发性凋亡组比较

46、有明显的差异性（Plt;0.05） 。3.流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR 诱导中性粒细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 AG490（JAK/STAT 抑制剂） ，H-89（PKA 抑制剂），U0126（ERK 抑制剂）单独与中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而 AG490 能减少 PGN 依赖的凋亡抑制，但 H-89、U0126 对 PGN 诱导的中性粒细胞无凋亡抑制作用；延伸用其它 TLR 配体检测发现 H-89，U0126 对 TLR 诱导中性粒细胞生存也无影响作用，而 AG490 对 LPS、PGN、R848、MALP-2 诱导的中性粒细胞生存有相似

47、的抑制效应。4.培养 2h 和 8h 后，将各模型组中的中性粒细胞裂解，抽提总蛋白进行 SDS-PAGE 并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下，中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5.TLR配体刺激中性粒细胞 0h、1h、2h、4h、8h 后，提取蛋白并用 Western blotting 技术检测比较 Bak 蛋白的表达。结果显示：与自发性凋亡组相比，LPS、PGN、flagellin、Pam3CSK4、R848、MALP-2、CpG-DNA 和 loxoribine 对中性粒细胞内 Bak 蛋白的表达量无明显作用，Bak 的表达率与 TLR 两者之间无明显的时效关系

48、。 结论：1.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4 和 CpG-DNA在 8h 能延迟纯化中性粒细胞的自发性凋亡；而 flagellin 和 loxoribine 在 8h对延迟纯化中性粒细胞凋亡是低效或无效的。2.JAK/STAT 信号通路抑制剂AG490 在 8h 能减少 LPS、PGN、R848、MALP-2 依赖的凋亡抑制，对诱导的中性粒细胞生存有抑制作用。JAK/STAT 信号转导通路可能参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞生存的信号转导途径。3.LPS、PGN、R848、MALP-2、Pam3CSK4、CpG-DNA、flagellin 和 loxoribine

49、这 8 种不同的 TLR 配体对 Bak 蛋白的表达影响与 TLR 类型可能无关。Bak 可能不参与 TLR 配体诱导的中性粒细胞死亡的信号转导途径。目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是机体重要的炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序，这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）区别自身抗原和病原体以启动活化。TLR 是天然免疫系统中特异的-型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR 能特异的识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP） ，构成机体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的 TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR 信号转导级联的激活有助于清除病原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR 可激活核转录因子（nuclear factor-B，NF-B） 、