1、医学基础药理学专业优秀论文 新型化合物甲胺鸢尾素对急性心肌缺血损伤的保护作用及机制研究关键词：甲胺鸢尾素 心肌缺血 心功能 心肌保护 基础药理 血管新生摘要：研究目的： 急性心肌缺血性损伤（Acute Myocardial Ischemia，AMI）是严重危害我国中老年人健康的重大疾病，也是最常见的猝死原因之一。心肌缺血后的修复过程及预后与缺血心肌血管的功能状态密切相关，缺血区内是否有血管迅速生成对于心肌缺血后建立良好的侧支循环、改善缺血区血液供应、促进缺血区心肌的存活具有非常重要的意义。介入治疗如经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）和冠状动脉内支架是目前 AMI 后血运重建的常用方法，但由于介
2、入治疗只适于直径gt;2mm 的动脉，对直径lt;2 mm 的动脉和具体负责灌注的微小血管则无能为力，且存在术后再狭窄（2550）问题，以至有相当多的病人（2037）不能达到完全血运重建而影响预后。除了残存血管的重新开放，近年来，诱导血管新生以重建血运挽救濒死的心肌成为治疗 AMI 所致心肌损伤的一个新策略，这种方法又被称为“治疗性血管新生” 。虽然目前对血管新生及治疗性血管新生进行了较多的基础及临床方面的研究，各种血管生长因子及转基因治疗的促进血管新生作用己被认可，但由于多种血管生长因子本身的局限性和应用的烦琐及转基因治疗中尚存在许多问题使其在临床上的应用受到限制，所以需要寻找以诱导血管新生
3、为靶点的更方便、有效、实用的药物来代替生长因子。 我们前期的研究结果表明，从葛花中提取分离的异黄酮化合物葛花苷具有明显的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性，亦具有明显的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用，但是该化合物水溶性较差，使其研究受到一定的限制。因此，我们对葛花苷结构进行修饰，在保留活性基团的基础上，增加水溶性基团，克服该化合物所存在的不足，得到一个新型化合物-甲胺鸢尾素。该化合物水溶性增加，易吸收。小鼠急性毒性实验和体外细胞毒实验表明，该新型化合物毒性较低。我们拟在此基础上深入研究这一新型化合物对缺血心肌的保护作用，从其对缺血心肌心功能、缺血缺氧/再灌注损伤、促血管新生信号通路因子（HIF-1、
4、VEGF、NO）等多方面深入研究其作用机制，为缺血性心脏病的治疗提供新的药物靶点和创新型药物。 研究方法： 本研究分为两大部分。第一部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素对心肌缺血损伤的保护作用及其机制。第二部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促进血管新生的的作用与机制。 第一部分：甲胺鸢尾素改善急性心肌缺血损伤的作用及机制研究 首先，体内实验观察了新型化合物甲胺鸢尾素对健康小鼠常压耐缺氧存活时间、电刺激大鼠血栓形成时间及对正常大鼠血液粘度的影响，研究甲胺鸢尾素对动物耗氧量及血液流变学的影响；分别采用异丙肾上腺素多次皮下注射和经典的冠状动脉结扎方法建立急性心肌缺血损伤模型，观察甲胺鸢
5、尾素对缺血心肌病理改变、缺血/梗塞面积、心肌酶、心功能、血浆 CGRP 和 ET-1 水平等的影响，探讨其对心肌缺血损伤的保护作用。 其次，体外实验以原代培养的 Wistar 乳鼠心肌细胞为研究对象，以高纯氮气（99）饱和与否建立细胞缺血再灌注损伤（缺氧 3h、再灌注 6h）模型，以甲胺鸢尾素对损伤心肌细胞形态的变化及细胞存活率的影响、对损伤细胞超氧化物岐化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）的释放量、活性氧生成量、线粒体膜电位、凋亡细胞比率及细胞内钙含量等为观察指标，从细胞水平上探讨甲胺鸢尾素保护心肌细胞缺血损伤的作用机制。 第二部分：甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促
6、血管新生的作用与机制研究 采用结扎大鼠冠状动脉前降支方法造成急性心肌缺血损伤模型，观察甲胺鸢尾素连续给药 30 天对缺血心肌梗塞边缘区血管新生的作用、对梗塞边缘区心肌超微结构的影响；分别采用免疫组化、Western blot、实时定量 PCR 等方法定性、定量的观察甲胺鸢尾素对缺血心肌缺氧诱导因子-1（HIF-1）及其调节的下游靶基因血管内皮细胞生长因子（VEGF） 、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响；分别采用 ELISA、放免、酶检测法检测甲胺鸢尾素对血清 VEGF、血浆降钙素基因相关肽（CGRP）和内皮素（ET-1）水平、血清一氧化氮（NO）含量的影响；观察甲胺鸢尾素对培养的人脐静
7、脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移和管样结构形成以及缺氧损伤后 NO 含量的影响，明确甲胺鸢尾素在急性心肌缺血后促进血管新生的作用与机制。 结果： 1.甲胺鸢尾素一次性腹腔注射给药300mg/kg 和 150mg/kg 均能明显增加小鼠常压下耐缺氧存活时间（Plt;0.01） ；200、100mg/kg 剂量可明显降低大鼠血液粘度（Plt;0.01） ，延长电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间（Plt;0.05） 。 2.甲胺鸢尾素 200、100mg/kg 对异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用，能减轻异丙肾上腺素对心肌缺血的病理性损害，稳定细胞膜，使心肌酶释放减少，与对照组比较差异显
8、著（Plt;0.05） 。 3.甲胺鸢尾素80mg/kg 剂量组明显减轻犬急性心肌缺血程度（-ST） 、缩小缺血范围（N-ST） 、缩小心肌梗塞面积；40mg/kg 剂量组有降低心肌缺血程度和缩小心肌梗塞范围的趋势，但与模型组比较无明显差异（Pgt;0.05） 。甲胺鸢尾素 80mg/kg剂量组给药后 2-4h 使血清磷酸肌酸激酶同功酶（CK-MB） 、LDH 释放量明显降低。40mg/kg 剂量组给药后 4h 显著降低 LDH 释放量（Plt;0.05） ，对血清谷草转氨酶（AST） 、磷酸肌酸激酶（CK）有降低趋势，但与模型组比较无明显差异（Pgt;0.05） 。 4.甲胺鸢尾素 200m
9、g/kg 剂量组可以明显改善大鼠急性心肌梗塞后心肌病理改变；使心肌收缩压、舒张压、左室内压升高，心率减慢（Plt;0.01） ；血浆 CGRP 和 ET-1 水平达到稳态平衡。 5.甲胺鸢尾素（10-7 M，10-6 M，10-5 M）能明显提高缺血（3h）再灌注（6h）损伤细胞存活率，提高细胞内 SOD 活性，明显降低细胞内 MDA 和 ROS 生成量、降低凋亡细胞比率，升高线粒体膜电位、明显降低细胞内钙含量，与模型组比较差异显著（Plt;0.01） 。 6.甲胺鸢尾素使急性心肌缺血边缘区心肌新生毛细血管密度增加；明显改善缺血心肌的超微结构。 结论； 1.甲胺鸢尾素能明显增加耐缺氧小鼠存活时
10、间、延长电刺激大鼠血栓形成时间、降低大鼠血液粘度；减轻异丙肾上腺素对心肌的病理性损害、减少心肌酶的释放；明显减轻冠脉结扎犬心肌缺血/梗塞面积；明显改善急性心肌梗塞后大鼠心功能，具有明显的心肌缺血保护作用，其机制可能与改善受损心肌供血、供氧，稳定细胞膜，从而调节能量代谢、改善血液流变作用有关。 2.甲胺鸢尾素可提高缺血再灌注损伤细胞存活率、提高氧自由基清除能力、降低细胞活性氧水平、升高线粒体膜电位。其机制可能与增强机体抗氧化酶活性、降低缺氧再给氧产生的活性氧水平，从而改善线粒体功能、降低细胞内钙超载有关。 3.缺血缺氧损伤心肌HIF-1 基因表达未见明显变化、蛋白表达增加，VEGF 基因和蛋白表
11、达均明显增加，NOS 活性增强、NO 合成增加，说明在我们的实验条件中缺血缺氧并不影响 HIF-1 基因表达，但可减少其降解，增加其活性，启动 HIF-1-VEGF-NO信号通路的转导，代偿性起到心肌保护作用。但是随着缺血时间的延长，代偿作用减弱。因此，维持 HIF-1-VEGF-NO 信号通路的转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。 4.甲胺鸢尾素能明显增加心肌缺血边缘区微血管形成，可使HIF-1、VEGF 表达均维持在较高水平，血清 VEGF、NO 水平升高，说明其可以促进 HIF-1-VEGF-NO 这一信号通路的转导，从而改善缺血心肌微循环和氧的供需平衡，起到“药物搭桥”治疗心肌缺血的作用
12、。 5.甲胺鸢尾素可以促进体外培养的 HUVEC 细胞增殖、迁移和管样结构形成，增加内皮细胞 NOS 合成分泌 NO 的能力，这可能是其发挥改善微循环、增加缺血区血供，从而产生“治疗性血管新生”的机制之一。本研究的意义与创新点心肌缺血性损伤是严重危害人类健康的重要疾病，研究防治此类疾病的药物并探讨其机制具有重要的理论意义和现实意义。本研究明确了新型化合物甲胺鸢尾素对缺血心肌的保护作用及其机制，为其防治缺血性心脏病的研究开发提供理论基础。 主要创新点： 1.对葛花苷进行结构修饰，得到有良好药理活性的具有自主知识产权的新型化合物-甲胺鸢尾素，申报国家专利号：200610068403.5。 2.对心
13、肌缺血模型中血浆 CGRP 和 ET-1 水平进行动态监测，明确心肌缺血发生发展的病理生理基础；明确了促进 HIF-1-VEGF-NO 信号通路的转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。 3.阐明了甲胺鸢尾素可以通过稳定细胞膜、改善微循环、降低钙超载、减轻线粒体损伤，促进 HIF-1-VEGF-NO 这一信号通路的转导，从而提高促血管新生因子（HIF-1、VEGF、eNOS）的表达，发挥心肌缺血的保护作用。 4.本课题研究为中药黄酮类提取物的研究提供思路。正文内容研究目的： 急性心肌缺血性损伤（Acute Myocardial Ischemia，AMI）是严重危害我国中老年人健康的重大疾病，也是最常
14、见的猝死原因之一。心肌缺血后的修复过程及预后与缺血心肌血管的功能状态密切相关，缺血区内是否有血管迅速生成对于心肌缺血后建立良好的侧支循环、改善缺血区血液供应、促进缺血区心肌的存活具有非常重要的意义。介入治疗如经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）和冠状动脉内支架是目前 AMI 后血运重建的常用方法，但由于介入治疗只适于直径gt;2mm 的动脉，对直径lt;2 mm 的动脉和具体负责灌注的微小血管则无能为力，且存在术后再狭窄（2550）问题，以至有相当多的病人（2037）不能达到完全血运重建而影响预后。除了残存血管的重新开放，近年来，诱导血管新生以重建血运挽救濒死的心肌成为治疗AMI 所致心肌损伤的
15、一个新策略，这种方法又被称为“治疗性血管新生” 。虽然目前对血管新生及治疗性血管新生进行了较多的基础及临床方面的研究，各种血管生长因子及转基因治疗的促进血管新生作用己被认可，但由于多种血管生长因子本身的局限性和应用的烦琐及转基因治疗中尚存在许多问题使其在临床上的应用受到限制，所以需要寻找以诱导血管新生为靶点的更方便、有效、实用的药物来代替生长因子。 我们前期的研究结果表明，从葛花中提取分离的异黄酮化合物葛花苷具有明显的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性，亦具有明显的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用，但是该化合物水溶性较差，使其研究受到一定的限制。因此，我们对葛花苷结构进行修饰，在保留活性基团的基础上，
16、增加水溶性基团，克服该化合物所存在的不足，得到一个新型化合物-甲胺鸢尾素。该化合物水溶性增加，易吸收。小鼠急性毒性实验和体外细胞毒实验表明，该新型化合物毒性较低。我们拟在此基础上深入研究这一新型化合物对缺血心肌的保护作用，从其对缺血心肌心功能、缺血缺氧/再灌注损伤、促血管新生信号通路因子（HIF-1、VEGF、NO）等多方面深入研究其作用机制，为缺血性心脏病的治疗提供新的药物靶点和创新型药物。 研究方法： 本研究分为两大部分。第一部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素对心肌缺血损伤的保护作用及其机制。第二部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促进血管新生的的作用与机制。 第一部分：甲胺
17、鸢尾素改善急性心肌缺血损伤的作用及机制研究 首先，体内实验观察了新型化合物甲胺鸢尾素对健康小鼠常压耐缺氧存活时间、电刺激大鼠血栓形成时间及对正常大鼠血液粘度的影响，研究甲胺鸢尾素对动物耗氧量及血液流变学的影响；分别采用异丙肾上腺素多次皮下注射和经典的冠状动脉结扎方法建立急性心肌缺血损伤模型，观察甲胺鸢尾素对缺血心肌病理改变、缺血/梗塞面积、心肌酶、心功能、血浆 CGRP 和ET-1 水平等的影响，探讨其对心肌缺血损伤的保护作用。 其次，体外实验以原代培养的 Wistar 乳鼠心肌细胞为研究对象，以高纯氮气（99）饱和与否建立细胞缺血再灌注损伤（缺氧 3h、再灌注 6h）模型，以甲胺鸢尾素对损伤
18、心肌细胞形态的变化及细胞存活率的影响、对损伤细胞超氧化物岐化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脱氢酶（LDH）的释放量、活性氧生成量、线粒体膜电位、凋亡细胞比率及细胞内钙含量等为观察指标，从细胞水平上探讨甲胺鸢尾素保护心肌细胞缺血损伤的作用机制。 第二部分：甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促血管新生的作用与机制研究 采用结扎大鼠冠状动脉前降支方法造成急性心肌缺血损伤模型，观察甲胺鸢尾素连续给药 30 天对缺血心肌梗塞边缘区血管新生的作用、对梗塞边缘区心肌超微结构的影响；分别采用免疫组化、Western blot、实时定量 PCR 等方法定性、定量的观察甲胺鸢尾素对缺血心肌缺氧诱导因子-
19、1（HIF-1）及其调节的下游靶基因血管内皮细胞生长因子（VEGF） 、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响；分别采用 ELISA、放免、酶检测法检测甲胺鸢尾素对血清 VEGF、血浆降钙素基因相关肽（CGRP）和内皮素（ET-1）水平、血清一氧化氮（NO）含量的影响；观察甲胺鸢尾素对培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移和管样结构形成以及缺氧损伤后NO 含量的影响，明确甲胺鸢尾素在急性心肌缺血后促进血管新生的作用与机制。结果： 1.甲胺鸢尾素一次性腹腔注射给药 300mg/kg 和 150mg/kg 均能明显增加小鼠常压下耐缺氧存活时间（Plt;0.01） ；200、100mg/k
20、g 剂量可明显降低大鼠血液粘度（Plt;0.01） ，延长电刺激大鼠颈动脉血栓形成时间（Plt;0.05） 。 2.甲胺鸢尾素 200、100mg/kg 对异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血损伤具有明显的保护作用，能减轻异丙肾上腺素对心肌缺血的病理性损害，稳定细胞膜，使心肌酶释放减少，与对照组比较差异显著（Plt;0.05） 。 3.甲胺鸢尾素 80mg/kg 剂量组明显减轻犬急性心肌缺血程度（-ST） 、缩小缺血范围（N-ST） 、缩小心肌梗塞面积；40mg/kg 剂量组有降低心肌缺血程度和缩小心肌梗塞范围的趋势，但与模型组比较无明显差异（Pgt;0.05） 。甲胺鸢尾素 80mg/kg 剂量组给
21、药后 2-4h 使血清磷酸肌酸激酶同功酶（CK-MB） 、LDH 释放量明显降低。40mg/kg 剂量组给药后 4h 显著降低LDH 释放量（Plt;0.05） ，对血清谷草转氨酶（AST） 、磷酸肌酸激酶（CK）有降低趋势，但与模型组比较无明显差异（Pgt;0.05） 。 4.甲胺鸢尾素 200mg/kg 剂量组可以明显改善大鼠急性心肌梗塞后心肌病理改变；使心肌收缩压、舒张压、左室内压升高，心率减慢（Plt;0.01） ；血浆 CGRP和 ET-1 水平达到稳态平衡。 5.甲胺鸢尾素（10-7 M，10-6 M，10-5 M）能明显提高缺血（3h）再灌注（6h）损伤细胞存活率，提高细胞内 S
22、OD 活性，明显降低细胞内 MDA 和 ROS 生成量、降低凋亡细胞比率，升高线粒体膜电位、明显降低细胞内钙含量，与模型组比较差异显著（Plt;0.01） 。 6.甲胺鸢尾素使急性心肌缺血边缘区心肌新生毛细血管密度增加；明显改善缺血心肌的超微结构。 结论； 1.甲胺鸢尾素能明显增加耐缺氧小鼠存活时间、延长电刺激大鼠血栓形成时间、降低大鼠血液粘度；减轻异丙肾上腺素对心肌的病理性损害、减少心肌酶的释放；明显减轻冠脉结扎犬心肌缺血/梗塞面积；明显改善急性心肌梗塞后大鼠心功能，具有明显的心肌缺血保护作用，其机制可能与改善受损心肌供血、供氧，稳定细胞膜，从而调节能量代谢、改善血液流变作用有关。 2.甲胺
23、鸢尾素可提高缺血再灌注损伤细胞存活率、提高氧自由基清除能力、降低细胞活性氧水平、升高线粒体膜电位。其机制可能与增强机体抗氧化酶活性、降低缺氧再给氧产生的活性氧水平，从而改善线粒体功能、降低细胞内钙超载有关。 3.缺血缺氧损伤心肌 HIF-1 基因表达未见明显变化、蛋白表达增加，VEGF 基因和蛋白表达均明显增加，NOS 活性增强、NO 合成增加，说明在我们的实验条件中缺血缺氧并不影响 HIF-1 基因表达，但可减少其降解，增加其活性，启动 HIF-1-VEGF-NO 信号通路的转导，代偿性起到心肌保护作用。但是随着缺血时间的延长，代偿作用减弱。因此，维持 HIF-1-VEGF-NO 信号通路的
24、转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。 4.甲胺鸢尾素能明显增加心肌缺血边缘区微血管形成，可使 HIF-1、VEGF 表达均维持在较高水平，血清 VEGF、NO 水平升高，说明其可以促进 HIF-1-VEGF-NO 这一信号通路的转导，从而改善缺血心肌微循环和氧的供需平衡，起到“药物搭桥”治疗心肌缺血的作用。 5.甲胺鸢尾素可以促进体外培养的 HUVEC 细胞增殖、迁移和管样结构形成，增加内皮细胞 NOS 合成分泌 NO 的能力，这可能是其发挥改善微循环、增加缺血区血供，从而产生“治疗性血管新生”的机制之一。本研究的意义与创新点心肌缺血性损伤是严重危害人类健康的重要疾病，研究防治此类疾病的药物并探
25、讨其机制具有重要的理论意义和现实意义。本研究明确了新型化合物甲胺鸢尾素对缺血心肌的保护作用及其机制，为其防治缺血性心脏病的研究开发提供理论基础。 主要创新点： 1.对葛花苷进行结构修饰，得到有良好药理活性的具有自主知识产权的新型化合物-甲胺鸢尾素，申报国家专利号：200610068403.5。 2.对心肌缺血模型中血浆 CGRP 和 ET-1 水平进行动态监测，明确心肌缺血发生发展的病理生理基础；明确了促进 HIF-1-VEGF-NO 信号通路的转导是治疗缺血性心脏病的靶点之一。 3.阐明了甲胺鸢尾素可以通过稳定细胞膜、改善微循环、降低钙超载、减轻线粒体损伤，促进 HIF-1-VEGF-NO
26、这一信号通路的转导，从而提高促血管新生因子（HIF-1、VEGF、eNOS）的表达，发挥心肌缺血的保护作用。 4.本课题研究为中药黄酮类提取物的研究提供思路。研究目的： 急性心肌缺血性损伤（Acute Myocardial Ischemia，AMI）是严重危害我国中老年人健康的重大疾病，也是最常见的猝死原因之一。心肌缺血后的修复过程及预后与缺血心肌血管的功能状态密切相关，缺血区内是否有血管迅速生成对于心肌缺血后建立良好的侧支循环、改善缺血区血液供应、促进缺血区心肌的存活具有非常重要的意义。介入治疗如经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）和冠状动脉内支架是目前 AMI 后血运重建的常用方法，但由于介
27、入治疗只适于直径gt;2mm 的动脉，对直径lt;2 mm 的动脉和具体负责灌注的微小血管则无能为力，且存在术后再狭窄（2550）问题，以至有相当多的病人（2037）不能达到完全血运重建而影响预后。除了残存血管的重新开放，近年来，诱导血管新生以重建血运挽救濒死的心肌成为治疗 AMI所致心肌损伤的一个新策略，这种方法又被称为“治疗性血管新生” 。虽然目前对血管新生及治疗性血管新生进行了较多的基础及临床方面的研究，各种血管生长因子及转基因治疗的促进血管新生作用己被认可，但由于多种血管生长因子本身的局限性和应用的烦琐及转基因治疗中尚存在许多问题使其在临床上的应用受到限制，所以需要寻找以诱导血管新生为
28、靶点的更方便、有效、实用的药物来代替生长因子。 我们前期的研究结果表明，从葛花中提取分离的异黄酮化合物葛花苷具有明显的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性，亦具有明显的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用，但是该化合物水溶性较差，使其研究受到一定的限制。因此，我们对葛花苷结构进行修饰，在保留活性基团的基础上，增加水溶性基团，克服该化合物所存在的不足，得到一个新型化合物-甲胺鸢尾素。该化合物水溶性增加，易吸收。小鼠急性毒性实验和体外细胞毒实验表明，该新型化合物毒性较低。我们拟在此基础上深入研究这一新型化合物对缺血心肌的保护作用，从其对缺血心肌心功能、缺血缺氧/再灌注损伤、促血管新生信号通路因子（HIF-1、V
29、EGF、NO）等多方面深入研究其作用机制，为缺血性心脏病的治疗提供新的药物靶点和创新型药物。 研究方法： 本研究分为两大部分。第一部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素对心肌缺血损伤的保护作用及其机制。第二部分采用体内外实验研究甲胺鸢尾素在急性心肌缺血损伤后促进血管新生的的作用与机制。 第一部分：甲胺鸢尾素改善急性心肌缺血损伤的作用及机制研究 首先，体内实验观察了新型化合物甲胺鸢尾素对健康小鼠常压耐缺氧存活时间、电刺激大鼠血栓形成时间及对正常大鼠血液粘度的影响，研究甲胺鸢尾素对动物耗氧量及血液流变学的影响；分别采用异丙肾上腺素多次皮下注射和经典的冠状动脉结扎方法建立急性心肌缺血损伤模型，观察甲胺鸢尾
30、素对缺血心肌病理改变、缺血/梗塞面积、心肌酶、心功能、血浆 CGRP 和ET-1 水平等的影响，探讨其对心肌缺血损伤的保护作用。 其次，体外实验以原代培养的 Wistar 乳鼠心肌细胞为研究对象，以高纯氮气（99）饱和与否建立细胞缺血再灌注损伤（缺氧 3h、再灌注 6h）模型，以甲胺鸢尾素对损伤心肌细胞形态的变化特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?e
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