1、创伤医学专业优秀论文 大剂量 GC对下丘脑神经元Ca的影响及其机制研究关键词：糖皮质激素 下丘脑神经元 钙离子浓度 地塞米松摘要：糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要
2、的钙清除分子PMCA、NCX 和 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMS
3、O 组(各组实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10
4、-6M DEX组、KB-R7943 预处理+10-6M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微
5、镜记录加入 DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显
6、示新方法培养的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘
7、脑神经元内钙离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下
8、降，这种现象由 iGR介导，通过增加 PMCA活性加速胞浆内钙离子清除而实现，细胞内 PKC信号通路参与其中。正文内容糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子
9、PMCA、NCX 和 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组
10、实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DE
11、X组、KB-R7943 预处理+10-6M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入
12、DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养
13、的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙
14、离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降，这种现象
15、由 iGR介导，通过增加 PMCA活性加速胞浆内钙离子清除而实现，细胞内 PKC信号通路参与其中。糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子PMCA、NCX 和
16、 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组实验均在无钙环境中进
17、行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DEX组、KB-R794
18、3 预处理+10-6M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入 DEX前后神经元内钙
19、荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养的神经元生长迅速，胶
20、质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙离子，从而导致神经元
21、内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降，这种现象由 iGR介导，通过
22、增加 PMCA活性加速胞浆内钙离子清除而实现，细胞内 PKC信号通路参与其中。糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子PMCA、NCX 和 SERCA的干预，
23、探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo
24、-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DEX组、KB-R7943 预处理+10-6
25、M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入 DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂
26、量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天
27、之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下
28、降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降，这种现象由 iGR介导，通过增加 PMCA活性加
29、速胞浆内钙离子清除而实现，细胞内 PKC信号通路参与其中。糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子PMCA、NCX 和 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导
30、下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针
31、标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DEX组、KB-R7943 预处理+10-6M DEX 组、毒胡
32、箩卜素预处理+10-6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入 DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神
33、经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，
34、胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和
35、 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降，这种现象由 iGR介导，通过增加 PMCA活性加速胞浆内钙离子清除而
36、实现，细胞内 PKC信号通路参与其中。糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子PMCA、NCX 和 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+
37、i 迅速下降的通路与其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游
38、离钙离子，用激光共聚焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DEX组、KB-R7943 预处理+10-6M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-
39、6M DEX 组、pH8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入 DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降
40、的信号通路研究 实验分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，
41、均达高峰，且无过于广泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不
42、能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外无钙条件下，10-6M 的 DEX可以引发下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降，这种现象由 iGR介导，通过增加 PMCA活性加速胞浆内钙离子清除而实现，细胞内 PKC
43、信号通路参与其中。糖皮质激素(GC)是一种由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，是下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的重要环节、机体最重要的应激反应激素之一。我课题组前期实验发现大剂量 GC(10-6M的地塞米松)能够引起培养的下丘脑神经元内钙离子浓度(Ca2+i)的迅速变化，特别是在特定条件下地塞米松(DEX)可引发下丘脑神经元内Ca2+1 迅速而显著的降低。其原因与意义均尚不清楚。 研究目的: 本研究旨在观察研究大剂量 GC作用时，下丘脑神经元Ca2+i 的变化特点与规律，并通过对三种主要的钙清除分子PMCA、NCX 和 SERCA的干预，探讨大剂量 GC介导下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降的通路与
44、其可能机制。 方法和步骤: 1.神经元培养与鉴定 采用 Velasco的神经元培养方法，并做适当的改进应用于培养下丘脑神经元。在显微镜下观察记录神经元的胞体面积和轴突长度变化，并用 NF-200免疫化学染色方法对培养神经元的纯度进行鉴定，通过以上指标评价神经元生长情况。 2.无钙环境下 10-6M的 DEX致下丘脑神经元Ca2+i下降的规律研究 将培养的神经元分为 10-6M DEX组、10-9M DEX 组、RU486处理+10-6M DEX 组，D#39;hanks 液组、DMSO 组(各组实验均在无钙环境中进行)；使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记下丘脑神经元内游离钙离子，用激光共聚
45、焦显微镜动态扫描检测神经元内游离钙离子浓度变化。各组神经元在用激光共聚焦显微镜扫描 2030 秒后加入 D#39;hanks、DMSO、10-6M DEX、10-9M DEX 等刺激因素，RU486 处理+10-6M DEX 组预先加入 10-5M RU-486孵育 60 min，然后加入 10-6M进行刺激(以上浓度均为加入试剂后的最终浓度)。然后用激光共聚焦显微镜连续观察记录神经元内钙离子荧光变化。 3.大剂量DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的钙通道途径探讨 本实验分为 10-6M DEX组、KB-R7943 预处理+10-6M DEX 组、毒胡箩卜素预处理+10-6M DEX 组、p
46、H8.8缓冲液预处理+10-6M DEX 组(分别阻断 NCX、SERCA、PMCA)，比较各组 10-6M DEX刺激后神经元内Ca2+i 下降幅度。其中毒胡萝卜素组神经元使用 2M 的毒胡萝卜素常温预处理 5min； KB-R7943 组神经元使用 20M 的 KB-R7943预处理 10min； pH8.8 缓冲液组神经元使用 pH8.8细胞外缓冲液预处理 10min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)。使用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜记录加入 DEX前后神经元内钙荧光变化。 4.大剂量 DEX致下丘脑神经元Ca2+i 下降的信号通路研究 实验
47、分为以下 4个组：10-6M DEX组，pH 值 8.8的细胞外缓冲液处理+10-6M DEX 组，盐酸屈菜红碱预处理预处理(阻断 PKC)+10-6M DEX组，MDL-12330A 预处理(阻断 PKA)+10-6M DEX组。PKA和 PKC阻断剂预处理时间均为 15min，然后加入 DEX(终浓度 10-6M)进行刺激。用 Fluo-3/AM钙荧光探针标记细胞内游离钙离子，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光变化。 结果: 1.将改进后的神经元培养方法应用于培养下丘脑神经元，结果显示新方法培养的神经元生长迅速，胶质细胞少，3-7 天之间神经元形态饱满，胞体直径，突起长度，均达高峰，且无过于广
48、泛的突触连接和胶质细胞生长.为进行观察实验的最佳时期。 2.本部实验证明：在无钙的细胞外环境下，10-6M 的 DEX可以导致下丘脑神经元Ca2+i 迅速下降了20.59.9。这种现象可以被 GC的胞浆受体(iGR)阻断剂 RU-486阻断，提示iGR参与了 10-6M DEX所导致的下丘脑神经元Ca2+i 下降。 3.使用 pH值为8.8的细胞外液阻断 PMCA的活动，可以完全阻断 GC介导的下丘脑神经元内Ca2+i下降现象，提示大剂量 GC可以通过是通过迅速激活 PMCA清除下丘脑神经元内钙离子，从而导致神经元内Ca2+i 快速下降。而 SERCA和 NCX的阻断剂并不能阻断 DEX介导神经元Ca2+i 下降，说明二者并未参与其中。 4.本实验使用盐酸屈菜红碱抑制 PKC活性、用腺苷酸环化酶(AC)的抑制剂 MDL-12330A阻断 PKA信号途径。阻断 PKC信号通路后，完全抑制了 10-6M的 DEX所介导的下丘脑神经元Ca2+i 的下降现象。而阻断 PKA则不能阻断这一过程。提示 PKC途径参了 10-6M的 DEX介导的引发下丘脑神经元Ca2+i 下降。 结论: 上述实验结果提示：在细胞外
