1、内分泌与代谢病专业优秀论文 亮氨酸对胰岛 细胞的作用及机制研究：(AMPK)-(PDX-1)-(GCK/GLUT2)关键词：亮氨酸 2 型糖尿病 蛋白激酶 转录调控因子 体外培养 胰岛 细胞 动物模型 放射免疫法摘要：研究背景： 我们的实验旨在研究长期高浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量的影响，并且进一步研究其相关机制。 目的： 本研究利用体外培养的大鼠胰岛 细胞株在 RPMI1640 培养基中贴壁生长。不同类型的胰岛 细胞株以不同剂量亮氨酸为处理因素，以 AICAR 为 AMPK 激动剂，Compound C 为 AMPK 阻断剂，对以下问题进行探讨： 1观察长期不同浓度亮氨
2、酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放功能和胰岛素含量的影响。 2观察长期高浓度亮氨酸对 AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA 和蛋白表达的影响，探讨可能的机制。 3探讨在胰岛 细胞中，AMPK 与 PDX-1，GCK/GLUT2 的关系。 4探讨在胰岛 细胞中，AMPK 是否通过 PDX-1 影响 GCK/GLUT2。 5观察长期高浓度亮氨酸是否通过通路影响高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。 6在大鼠 INS-1 细胞中检测长期亮氨酸培养 24h 对胰岛素释放，胰岛素含量，PDX-1 以及其下游因子 GLUT2 蛋白的表达，并且探讨亮氨酸在抑制高糖刺激的胰岛素释放后，去除亮氨酸这个环
3、境条件，是否能够再恢复。 方法： 1INS-1 和 RIN m5F 胰岛细胞株的培养和分组：INS-1 与 RIN m5F 细胞在 RPMI1640 培养基中贴壁生长。实验分为六组：C 组，正常对照组；L 组，40mM 亮氨酸组；A 组，05 mMAICAR；C 组，10M Compound C；LA 组，L 与A 共培养； PC 组，P 与 C 共培养。处理时间：48 小时。 2INS-1，RIN m5F，DN-PDX-128 和 PDX-16 细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能以及胰岛素含量的测定与评价：INS-1 和 RIN m5F 细胞种于 24 孔板中，分组处理后，在葡萄糖浓度为 3M、
4、278 mM 的 KRB 缓冲液分别孵育 20min，收集上清，放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。 3细胞活力的检测：胰岛细胞株分组培养后，使用 CCK-8 方法检测细胞毒性。 4AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 的检测：在 INS-1，RIN m5F 细胞上，Real-timePCR 检测 NdPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA 的表达；Western blotting检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 蛋白表达。 5RPMI1640 培养 PDX-16 细胞株与 PDX-1 不表达的 PDX-128 细胞，加以强力霉
5、素，使 PDX-1 过表达以及不表达， RT-PCR 检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA 表达的变化：Western blotting 检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 蛋白表达。 结果： 1在 INS-1与 RIN m5F 细胞中 AICAR 与 Compound C 的作用 与正常组相比，AICAR 活化后降低 INS-1 细胞中高糖刺激的胰岛素释放 29并且降低细胞内胰岛素含量30；在 RIN m5F 细胞中，AICAR 活化后降低细胞内胰岛素含量降低 34。当AMPK 被 Compound C 抑制后，则起到相反的作用。与正常组相比，Compound
6、 C能够增加 INS-1 细胞高糖刺激的胰岛素释放 17和 INS-1 细胞内胰岛素含量19以及 RIN m5F 细胞 25。但是，无论是 AICAR 或者 Compound C 均不能影响 INS-1 细胞低糖刺激的基础胰岛素释放。 2在 DN-PDX-128 细胞中AICAR 与 Compound C 的作用 在未用强力霉素诱导的条件下，PDX-1 蛋白表达均很强，并且 POX-1 蛋白表达在强力霉素诱导 24 h，48 h 或者 72 h 没有显著差异。在 500ng/ml 强力霉素诱导条件下，随着时间延长，PDX-1 蛋白表达越来越弱，更近一步来说，最弱的条带出现在强力霉素诱导 72
7、小时组。与上述结果相对应，GLUT2 与 GCK 与 POX-1 一样有相似的结果。在未用强力霉素诱导的条件下，无论是 24 h，48 h 或者 72 h，GCK 与 GLUT2 蛋白表达均没有显著差异在 500 ng/ml 强力霉素诱导 24 h，48 h 或者 72 h 条件下，随着时间延长，GCK 与 GLUT2 蛋白表达越来越弱。 3不同浓度氨基酸在 INS-1 与 RIN m5F细胞对胰岛素分泌的影响 结果显示，当 INS-1 与 RIN m5F 细胞在不同浓度的亮氨酸中培育 48h 后，亮氨酸以剂量依赖方式抑制高糖刺激的胰岛素释放以及含量。与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著降
8、低高糖刺激的胰岛素释放34，并且显著降低胰岛素含量 24；但是对于低糖刺激的胰岛素释放没有显著影响。与正常对照组相比，10 mM 或者 20 mM 亮氨酸不能显著影响胰岛素释放和胰岛素含量在 INS-1 中。RIN m5F 细胞所呈现的趋势与 INS-1 细胞一样，与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著降低胰岛素含量 24。Western blotting，real-time PCR 方法被用来检测 p-AMPK，PDX-1，GCK GLUT2。与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著增强 p-AMPK 蛋白表达在 INS-1 细胞中和 RIN m5F 细胞中。 4亮氨酸在胰岛 细胞株中毒性
9、检测 结果显示，在 INS-1，RIN m5F，DN-PDX-128 和 PDX-16 cells 中，与正常组相比，10 mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为 99，97，98，98，20mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为 98，97，98，99，40 mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为97，97，96，95。这些结果证明无论是 10，20 或者 40 mM 亮氨酸对胰岛 细胞均没有细胞毒性作用。 5AICAR 或者 Compound C 在长期亮氨酸培养条件下对 INS-1 和 RIN mSF 细胞的作用 在 INS-1 和 RIN m5F 细胞中，单纯亮氨酸组，单纯 AICAR 组或者单纯 Co
10、mpound C 组产生与 Fig1 或者 Fig4相似的结果。此外，与单纯亮氨酸组相比，亮氨酸与 AICAR 共同培养组显著降低高糖刺激的胰岛素释放 21在 INS-1 中，降低细胞内胰岛素含量 23在INS-1 中，and26在 RIN m5F cells 中。更进一步，长期亮氨酸培养后引起高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量降低，亮氨酸与 Compound C 共同培养可以显著恢复降低的高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量。与单纯亮氨酸组相比，亮氨酸与 Compound C 共同培养显著增加高糖刺激的胰岛素释放 33在 INS-1 细胞中，增加胰岛素含量 24在 INS-1 细胞中，29在 RI
11、N m5F 中。 6不同浓度亮氨酸对胰岛素释放、胰岛素含量、以及胰岛 细胞蛋白的影响 我们的研究结果显示不同浓度的氨基酸培养 24 小时以剂量依赖形式抑制高糖高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量，40mmol/l 亮氨酸引起的作用最明显。与正常组相比，40mmol/l 亮氨酸显著抑制高糖刺激的胰岛素释放 11，胰岛素含量14，但是对低糖刺激的胰岛素释放没有显著作用。 724h 恢复后对胰岛素释放、含量以及胰岛 细胞蛋白表达的影响 结果显示与正常组相比，40 mmol/l 亮氨酸培养 24 h 显著降低高糖刺激的胰岛素释放 11（P=0026）和胰岛素含量 14（P=0008） ，并且 40 mm
12、ol/l 亮氨酸培养 48 h 显著降低高糖刺激的胰岛素释放 22（P=0003）和胰岛素含量 20（P=0002） 。当亮氨酸预培养 24h 后再去除亮氨酸在普通培养基中继续培养 24h，与那些在亮氨酸培养基中培样 24 h 或者 48 h，高糖刺激的胰岛素释放升高 13（P=0032）或者 27（P=0002） ，胰岛素含量升高 10（P=0014）或者20（P=0003） 。与正常组相比，亮氨酸培养降低 PDX-1 和 GLUT2 蛋白表达，亮氨酸培样 48 h 组最明显。亮氨酸培养 24 h 后降低的 PDX-1 和 GLUT2 蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养 24h 后可以基本恢复到
13、正常（P=0013；P=0015） 。与亮氨酸培养 48h 组相比，经过 24h 恢复培养后的 PDX-1 和 GLUT2 蛋白条带显著增强（P=0005；P=0006） 。 结论： 1理下的胰岛细胞株中，AMPK可以调节 GCK/GLUT2 的表达，并且这种调节可能是通过 PDX-1 发挥作用的。 2氨基酸环境，同样存在着 AMPK 通过 PD-1 调节 GCK/GLUT2 3长期高浓度亮氨酸培养可以活化 AMPK，然后降调 PDX-1 以及其下游因子 GCK 与 GLUT2 mRNA 和蛋白的表达，最终抑制高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。 4亮氨酸培养 24h 以剂量依赖方式抑制高糖刺
14、激的胰岛素释放和胰岛素含量在INS-1 细胞中，并伴随 PDX-1 以及其下游因子，GLUT2 蛋白的降低。并且亮氨酸培养 24 h 后降低的高糖刺激的胰岛素释放，胰岛素含量以及 PDX-1 和 GLUT2 蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养 24h 后可以基本恢复到正常。正文内容研究背景： 我们的实验旨在研究长期高浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量的影响，并且进一步研究其相关机制。 目的： 本研究利用体外培养的大鼠胰岛 细胞株在 RPMI1640 培养基中贴壁生长。不同类型的胰岛 细胞株以不同剂量亮氨酸为处理因素，以 AICAR 为 AMPK 激动剂，Compound C 为 A
15、MPK 阻断剂，对以下问题进行探讨： 1观察长期不同浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放功能和胰岛素含量的影响。 2观察长期高浓度亮氨酸对 AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA 和蛋白表达的影响，探讨可能的机制。 3探讨在胰岛 细胞中，AMPK 与 PDX-1，GCK/GLUT2 的关系。 4探讨在胰岛 细胞中，AMPK 是否通过 PDX-1 影响 GCK/GLUT2。 5观察长期高浓度亮氨酸是否通过通路影响高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。 6在大鼠 INS-1 细胞中检测长期亮氨酸培养 24h 对胰岛素释放，胰岛素含量，PDX-1 以及其下游因子 GLUT2 蛋白的表达，
16、并且探讨亮氨酸在抑制高糖刺激的胰岛素释放后，去除亮氨酸这个环境条件，是否能够再恢复。 方法： 1INS-1 和 RIN m5F 胰岛细胞株的培养和分组：INS-1 与 RIN m5F 细胞在 RPMI1640 培养基中贴壁生长。实验分为六组：C 组，正常对照组；L 组，40mM 亮氨酸组；A 组，05 mMAICAR；C 组，10M Compound C；LA 组，L 与A 共培养； PC 组，P 与 C 共培养。处理时间：48 小时。 2INS-1，RIN m5F，DN-PDX-128 和 PDX-16 细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能以及胰岛素含量的测定与评价：INS-1 和 RIN m5F
17、 细胞种于 24 孔板中，分组处理后，在葡萄糖浓度为 3M、278 mM 的 KRB 缓冲液分别孵育 20min，收集上清，放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。 3细胞活力的检测：胰岛细胞株分组培养后，使用 CCK-8 方法检测细胞毒性。 4AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 的检测：在 INS-1，RIN m5F 细胞上，Real-timePCR 检测 NdPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA 的表达；Western blotting检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 蛋白表达。 5RPMI1640 培养 PDX-16 细胞
18、株与 PDX-1 不表达的 PDX-128 细胞，加以强力霉素，使 PDX-1 过表达以及不表达， RT-PCR 检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA 表达的变化：Western blotting 检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 蛋白表达。 结果： 1在 INS-1与 RIN m5F 细胞中 AICAR 与 Compound C 的作用 与正常组相比，AICAR 活化后降低 INS-1 细胞中高糖刺激的胰岛素释放 29并且降低细胞内胰岛素含量30；在 RIN m5F 细胞中，AICAR 活化后降低细胞内胰岛素含量降低 34。当AMPK 被 Compound
19、C 抑制后，则起到相反的作用。与正常组相比，Compound C能够增加 INS-1 细胞高糖刺激的胰岛素释放 17和 INS-1 细胞内胰岛素含量19以及 RIN m5F 细胞 25。但是，无论是 AICAR 或者 Compound C 均不能影响 INS-1 细胞低糖刺激的基础胰岛素释放。 2在 DN-PDX-128 细胞中AICAR 与 Compound C 的作用 在未用强力霉素诱导的条件下，PDX-1 蛋白表达均很强，并且 POX-1 蛋白表达在强力霉素诱导 24 h，48 h 或者 72 h 没有显著差异。在 500ng/ml 强力霉素诱导条件下，随着时间延长，PDX-1 蛋白表达
20、越来越弱，更近一步来说，最弱的条带出现在强力霉素诱导 72 小时组。与上述结果相对应，GLUT2 与 GCK 与 POX-1 一样有相似的结果。在未用强力霉素诱导的条件下，无论是 24 h，48 h 或者 72 h，GCK 与 GLUT2 蛋白表达均没有显著差异在 500 ng/ml 强力霉素诱导 24 h，48 h 或者 72 h 条件下，随着时间延长，GCK 与 GLUT2 蛋白表达越来越弱。 3不同浓度氨基酸在 INS-1 与 RIN m5F细胞对胰岛素分泌的影响 结果显示，当 INS-1 与 RIN m5F 细胞在不同浓度的亮氨酸中培育 48h 后，亮氨酸以剂量依赖方式抑制高糖刺激的胰
21、岛素释放以及含量。与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著降低高糖刺激的胰岛素释放34，并且显著降低胰岛素含量 24；但是对于低糖刺激的胰岛素释放没有显著影响。与正常对照组相比，10 mM 或者 20 mM 亮氨酸不能显著影响胰岛素释放和胰岛素含量在 INS-1 中。RIN m5F 细胞所呈现的趋势与 INS-1 细胞一样，与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著降低胰岛素含量 24。Western blotting，real-time PCR 方法被用来检测 p-AMPK，PDX-1，GCK GLUT2。与正常对照组相比，40 mM 亮氨酸显著增强 p-AMPK 蛋白表达在 INS-1 细胞
22、中和 RIN m5F 细胞中。 4亮氨酸在胰岛 细胞株中毒性检测 结果显示，在 INS-1，RIN m5F，DN-PDX-128 和 PDX-16 cells 中，与正常组相比，10 mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为 99，97，98，98，20mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为 98，97，98，99，40 mM 亮氨酸培养的细胞活力分别为97，97，96，95。这些结果证明无论是 10，20 或者 40 mM 亮氨酸对胰岛 细胞均没有细胞毒性作用。 5AICAR 或者 Compound C 在长期亮氨酸培养条件下对 INS-1 和 RIN mSF 细胞的作用 在 INS-1 和 RIN m5
23、F 细胞中，单纯亮氨酸组，单纯 AICAR 组或者单纯 Compound C 组产生与 Fig1 或者 Fig4相似的结果。此外，与单纯亮氨酸组相比，亮氨酸与 AICAR 共同培养组显著降低高糖刺激的胰岛素释放 21在 INS-1 中，降低细胞内胰岛素含量 23在INS-1 中，and26在 RIN m5F cells 中。更进一步，长期亮氨酸培养后引起高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量降低，亮氨酸与 Compound C 共同培养可以显著恢复降低的高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量。与单纯亮氨酸组相比，亮氨酸与 Compound C 共同培养显著增加高糖刺激的胰岛素释放 33在 INS-1 细胞
24、中，增加胰岛素含量 24在 INS-1 细胞中，29在 RIN m5F 中。 6不同浓度亮氨酸对胰岛素释放、胰岛素含量、以及胰岛 细胞蛋白的影响 我们的研究结果显示不同浓度的氨基酸培养 24 小时以剂量依赖形式抑制高糖高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量，40mmol/l 亮氨酸引起的作用最明显。与正常组相比，40mmol/l 亮氨酸显著抑制高糖刺激的胰岛素释放 11，胰岛素含量14，但是对低糖刺激的胰岛素释放没有显著作用。 724h 恢复后对胰岛素释放、含量以及胰岛 细胞蛋白表达的影响 结果显示与正常组相比，40 mmol/l 亮氨酸培养 24 h 显著降低高糖刺激的胰岛素释放 11（P=00
25、26）和胰岛素含量 14（P=0008） ，并且 40 mmol/l 亮氨酸培养 48 h 显著降低高糖刺激的胰岛素释放 22（P=0003）和胰岛素含量 20（P=0002） 。当亮氨酸预培养 24h 后再去除亮氨酸在普通培养基中继续培养 24h，与那些在亮氨酸培养基中培样 24 h 或者 48 h，高糖刺激的胰岛素释放升高 13（P=0032）或者 27（P=0002） ，胰岛素含量升高 10（P=0014）或者20（P=0003） 。与正常组相比，亮氨酸培养降低 PDX-1 和 GLUT2 蛋白表达，亮氨酸培样 48 h 组最明显。亮氨酸培养 24 h 后降低的 PDX-1 和 GLUT
26、2 蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养 24h 后可以基本恢复到正常（P=0013；P=0015） 。与亮氨酸培养 48h 组相比，经过 24h 恢复培养后的 PDX-1 和 GLUT2 蛋白条带显著增强（P=0005；P=0006） 。 结论： 1理下的胰岛细胞株中，AMPK可以调节 GCK/GLUT2 的表达，并且这种调节可能是通过 PDX-1 发挥作用的。 2氨基酸环境，同样存在着 AMPK 通过 PD-1 调节 GCK/GLUT2 3长期高浓度亮氨酸培养可以活化 AMPK，然后降调 PDX-1 以及其下游因子 GCK 与 GLUT2 mRNA 和蛋白的表达，最终抑制高糖刺激的胰岛素释放以及
27、胰岛素含量。 4亮氨酸培养 24h 以剂量依赖方式抑制高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量在INS-1 细胞中，并伴随 PDX-1 以及其下游因子，GLUT2 蛋白的降低。并且亮氨酸培养 24 h 后降低的高糖刺激的胰岛素释放，胰岛素含量以及 PDX-1 和 GLUT2 蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养 24h 后可以基本恢复到正常。研究背景： 我们的实验旨在研究长期高浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量的影响，并且进一步研究其相关机制。 目的： 本研究利用体外培养的大鼠胰岛 细胞株在 RPMI1640 培养基中贴壁生长。不同类型的胰岛 细胞株以不同剂量亮氨酸为处理因素，以 AICAR
28、 为 AMPK 激动剂，Compound C 为 AMPK 阻断剂，对以下问题进行探讨： 1观察长期不同浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放功能和胰岛素含量的影响。 2观察长期高浓度亮氨酸对 AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA 和蛋白表达的影响，探讨可能的机制。 3探讨在胰岛 细胞中，AMPK 与 PDX-1，GCK/GLUT2 的关系。4探讨在胰岛 细胞中，AMPK 是否通过 PDX-1 影响 GCK/GLUT2。 5观察长期高浓度亮氨酸是否通过通路影响高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。6在大鼠 INS-1 细胞中检测长期亮氨酸培养 24h 对胰岛素释放，胰岛素含量，PD
29、X-1 以及其下游因子 GLUT2 蛋白的表达，并且探讨亮氨酸在抑制高糖刺激的胰岛素释放后，去除亮氨酸这个环境条件，是否能够再恢复。 方法： 1INS-1 和 RIN m5F 胰岛细胞株的培养和分组：INS-1 与 RIN m5F 细胞在RPMI1640 培养基中贴壁生长。实验分为六组：C 组，正常对照组；L 组，40mM亮氨酸组；A 组，05 mMAICAR；C 组，10M Compound C；LA 组，L 与 A 共培养； PC 组，P 与 C 共培养。处理时间：48 小时。 2INS-1，RIN m5F，DN-PDX-128 和 PDX-16 细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能以及胰岛素含
30、量的测定与评价：INS-1 和 RIN m5F 细胞种于 24 孔板中，分组处理后，在葡萄糖浓度为 3M、278 mM 的 KRB 缓冲液分别孵育 20min，收集上清，放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。 3细胞活力的检测：胰岛细胞株分组培养后，使用 CCK-8 方法检测细胞毒性。 4AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 的检测：在 INS-1，RIN m5F 细胞上，Real-timePCR 检测 NdPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA 的表达；Western blotting 检测AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 蛋白表达。
31、 5RPMI1640 培养 PDX-16 细胞株与PDX-1 不表达的 PDX-128 细胞，加以强力霉素，使 PDX-1 过表达以及不表达，RT-PCR 检测 AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA 表达的变化：Weste特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅
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