1、中 晚 期 宫 颈 鳞 状 细 胞 癌 同 步 放 化 疗 敏 感 性 相 关 血 清miRNA的 临 床 研 究2017-12-19 12:32:08 中国现代医生 2017 年 31 期钱阅宬+张重寅+ 张鹏+ 周钗+吕晓娟摘要 目的 探討中晚期宫颈鳞状细胞癌同步放化疗敏感性相关的血清 miRNA。 方法 收集2014 年 212 月在我院妇科接受根治性同步放化疗的 20 例中晚期宫颈癌患者为研究对象，按照患者治疗过程及随访过程中肿瘤评估的情况，将研究对象分为同步放化疗抗拒组（n=10）和同步放化疗敏感组（n=10），筛选抗拒组和敏感组间具有显著表达差异的 miRNA，对比两组 miR-1
2、36-5p、 miR-152-3p、miR-206 的表达情况。 结果 在芯片筛选出的 miRNA 中，抗拒组和敏感组之间具有显著表达差异的 miRNA 有 3 个：抗拒组相较敏感组低表达的为 miR-136，抗拒组相较敏感组高表达的为 miR-152 和 miR-206。标本定量验证结果显示，敏感组 hsa-miR-136-5p 的表达水平高于抗拒组，差异有统计学意义（P0.05）。 结论 中晚期宫颈癌患者血清中 miRNA-136 的表达下调、miRNA-206 的表达上调可能与同步放化疗抗拒有关。关键词 宫颈鳞状细胞癌；miRNA；放疗；化疗；敏感性中图分类号 R737.33 文献标识码
3、 A 文章编号 1673-9701（2017 ）31-0001-04Abstract Objective To investigate the simultaneous chemoradiotherapy sensitivity related serum miRNAs of middle and advanced cervical squamous cell carcinoma. Methods A total of 20 patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma who underwent radi
4、cal concurrent radiotherapy and chemotherapy from February 2014 to December 2014 were enrolled in this study. According to the course of treatment and the evaluation of tumor during follow-up， the subjects were divided into simultaneous chemoradiotherapy resistant group（n=10） and simultaneous chemor
5、adiotherapy sensitive group（n=10）. The miRNAs with significant difference in expression between the resistant group and the sensitive group were screened. The expressions of miR-136-5p， miR-152-3p and miR-206 were compared between the two groups. Results In the miRNA selected by chip， there were thr
6、ee miRNAs with significant difference between the resistant group and the sensitive group. The expression of miR-136 was lower in the resistant group than that in the sensitive group， and the expressions of miR-152 and miR-206 were higher than those of the sensitive group. Specimen quantitative veri
7、fication results showed that the expression level of hsa-miR-136-5p in sensitive group was higher than that in resistant group， and the difference was significant（P0.05）. Conclusion The downregulation of miRNA-136 and upregulation of miRNA-206 may be related to the resistance of the simultaneous che
8、moradiotherapy in patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma.Key words Cervical squamous cell carcinoma； miRNA； Radiotherapy； Chemotherapy； Sensitivityendprint同步放化疗是中晚期宫颈癌常用的治疗方案，对降低中晚期宫颈癌的复发和病死风险具有重要价值1-2 。部分中晚期宫颈癌患者在接受同步放化疗后，病情暂时得到控制，但不久仍会出现复发和转移3。目前中晚期宫颈癌放化疗的敏感性已得到足够重视，但具体
9、机制目前尚未完全明晰，患者预后差，生存期明显缩短4。随着分子生物学的发展和进步及中晚期宫颈癌放化疗敏感性相关的生化因子不断被发现，其中与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性相关的血清 miRNA 也被不断重视5-6。本研究对此进行探讨，现报道如下。1 资料与方法1.1 一般资料收集 2014 年 212 月在我院妇科接受根治性同步放化疗的 20 例中晚期宫颈癌患者为研究对象，经病理活检结果，患者肿瘤分期为b-a 期，病理类型为宫颈鳞状细胞癌 7。患者年龄35 80 岁，平均（ 47.665.21）岁；病程 35 年，平均（2.320.64）年；其中 5 例患者有宫颈癌家族史。本项研究获我院伦理委员会审
10、批通过。纳入标准7：（ 1）FIGO 临床分期为ba 期；（2）同步放化疗前未接受过盆腔放疗与化疗；（3 ）KPS 评分 70 分；（4 ）患者知情同意。排除标准7：（1）患有其他系统的恶性肿瘤患者；（2）患有不能耐受放化疗治疗的疾病患者；（3 ）患有精神疾病、严重肝肾疾病者。1.2 方法1.2.1 治疗方法 对所有患者进行根治性同步放化疗。1.2.2 分组标准 以同步放化疗完成后 12 个月为界，按照患者治疗过程及随访过程中肿瘤评估的情况，将研究对象分为同步放化疗抗拒组（n=10）和同步放化疗敏感组（n=10 ），两组患者基本资料比较，差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。见表 1。1
11、.3 标本的收集采集所有患者清晨空腹血 4 mL，3500 rpm 轉速离心 5 min，提取上清液-80 C 保存待测。1.4 实验方法使用 miRNA 提取试剂盒进行 miR-214 抽提，实验过程按照试剂盒使用说明进行，抽提之后，使用核酸浓度检测仪检测 RNA 浓度和纯度，最后将其浓度稀释至 50 g/mL，使用特异性反转录引物进行 cDNA 合成，反应条件按照 cDNA 合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95 预变性10 min、95 变性 15 s、60 退火 32 s，循环 50 次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本 Ct 值，然后采用 2-Ct 计算
12、miRNA 的相对表达量。实验重复 3 次。用Megaplex RT Primers 反转录 miRNA 靶点及用可选的 Megaplex PreAmp Primers 预扩增之后，配制 PCRMix，TaqMan MiRNA Array（A+B ）上样，行标本定量验证，然后在 7900HT 定量 PCR 仪上运行分析。对比两组 miR-136-5p、miR-152-3p、miR-206 的表达情况。抗拒组和敏感组间差异表达的 miRNA 采用 TaqMan miRNA 表达谱芯片筛选。对 miRNA 芯片结果进行分析，以变化倍数Fold change2.0 或0.05）。见表 2。3 讨论最
13、近很多研究已经显示了 miRNA 表达在多种恶性肿瘤中都有相应的监管机制，包括肺癌、肝癌、结肠癌、神经胶质瘤等8-9。其中某些 miRNA 已经被广泛认可是关键的致癌基因或抑癌基因10。目前恶性肿瘤的治疗方案中，放射治疗是常见的治疗方案之一，尤其是针对非小细胞肺癌，放射治疗是出现播散和转移后的有效首选方案，但是其对放射剂量的耐受和敏感性降低是目前临床上存在的主要问题11。曾有学者研究指出部分 miRNA 在恶性肿瘤的放射治疗过程中对肿瘤细胞的放疗敏感反应有一定的调控作用。然而，目前尚没有关于 miR-214 在肺癌细胞中的表达和与放射治疗相关性的研究。因此，我们在肺癌类型中选取了非小细胞肺癌细
14、胞株进行 miRNA 分析和放疗敏感性的研究。目前 miRNA 表达谱芯片技术已被用于临床 miRNA 差异化表达的筛选中，被证明具有高敏感度和特异度12-14 。我们在研究中，将病例按照放化疗敏感性及是否出现抵抗分为敏感组和抗拒组，两组间病例基本资料匹配度良好，因此保证了两组间具有可比性。经使用 miRNA 表达谱芯片技术，我们筛选出 miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206 这 3 组表达存在显著差异的 miRNA。将miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206 进行扩大样本量行 PCR 检测，检测结果显示，敏感组和抗拒组间 miRNA-152 的表达不存在
15、统计学差异，但敏感组和抗拒组间 miRNA-136、miRNA-206 的表达仍然存在一定的统计学差异。我们发现，对同步放化疗抗拒的中晚期宫颈癌患者血清 miRNA-136呈低表达，而 miRNA-206 则呈高表达。表明 miRNA-136、miRNA-206 与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性具有一定的联系15-16 。因此我们对 miRNA-136、miRNA-206 与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性的关系进行重点探讨。endprintmiRNA-136 在不同类型的恶性肿瘤中发挥的作用不尽相同：在卵巢癌、肝癌等肿瘤组织中，miRNA-136 低表达17，而在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织中， m
16、iRNA-136 则呈现高表达13。有国外研究12显示，对顺铂耐药的卵巢上皮癌患者肿瘤组织中，miRNA-136 表达下调。而在对替莫唑胺耐药的神经胶质瘤患者组织中，miRNA-136 同样呈现低表达 18。我们的研究中，对同步放化疗抗拒的中晚期宫颈癌患者血清 miRNA-136 呈低表达，这与上述文献报道一致。表明 miRNA-136的表达下调与中晚期宫颈癌同步放化疗抗拒的产生有关。miRNA-136 诱导患者对化疗抗拒的可能机制为：miRNA-136 可以抑制肿瘤细胞凋亡，提高顺铂导致 DNA 损伤的修复能力19。miRNA-206 被认为与肌肉组织相关。 miRNA-206 在不同类型的
17、恶性肿瘤中情况相同，在肺癌、子宫内膜癌、横纹肌肉瘤等肿瘤中均表达下调20，但 miRNA-206 在乳腺癌中的表达与雌激素受体的表达有关，在雌激素受体阴性的患者组织中，miRNA-206 表达上调，而在雌激素受体阳性的患者组织中，miRNA-206 的表达下调 15。目前国内外有关 miRNA-206 的表达与恶性肿瘤放化疗敏感性关系的研究较少。本研究中，中晚期宫颈癌同步放化疗出现抗拒的患者组织中，miRNA-206 表达上调。这提示 miRNA-206 的表达状况与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性密切相关。本研究为相关研究提供了一定的依据。但有关 miRNA-206 的表达导致中晚期宫颈癌同步放
18、化疗抗拒的机制及相关信号通路仍然有待进一步深入研究。本研究结果表明，miRNA 作为与恶性肿瘤发病密切相关的生化指标，其表达水平与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性亦密切相关。因此临床上可以通过对相关 miRNA 进行靶向干预，进而提高中晚期宫颈癌患者对同步放化疗的敏感性，并提高治疗效果。中晚期宫颈癌患者血清中 miRNA-136 的表达下调、miRNA-206 的表达上调可能与同步放化疗抗拒有关。参考文献1 傅祝能，吴荣辉，孙海芳，等.HPV 感染、宫颈炎、CIN 及宫颈癌患者的宫颈黏膜脱落细胞端粒酶定量研究J.中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（1）：23-25.2 杜红雁，张海雁，张瑜，
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