1、海 南 大 学本 科 生 毕 业 论 文（设计）题 目：水律蛇病原菌的药敏实验 学 号： 20090109310033 姓 名： 年 级： 2009 级 学 院： 农学院 系 别： 动物科学系 专 业： 动物医学 指导教师： 完成日期： 2013 年 4 月 1 日 水律蛇病原菌的药敏实验 0摘 要 水律蛇（Mouse snake）也叫滑鼠蛇，是一种无毒且经济、药用价值都很高的蛇种，养殖水律蛇的效益很高，所以越来越多的人选择饲养水律蛇与研究水律蛇，本实验以能及时控制与治疗水律蛇间一种高度传染的细菌性急病、减少该疾病引起的危害为目的，研究该疾病，对引起该疾病的致病菌做一组药物敏感试验，以便准确、
2、针对性地用药，从而能及时控制与治疗该疾病，减少损失，本实验从病蛇体内抽取心脏血获取致病菌，通过分离及纯化得到三种致病菌（鲁氏耶而森氏菌的两种不同形态菌；木糖氧化产碱杆菌） ，实验通过K-B纸片法用多种抗菌药物分别对这三种致病菌进行药物敏感实验（drug sensitive test）与最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration）测试，实验结果表明这三种致病菌皆对氟啶酸、丙环派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等药为极敏，对乙酰螺旋霉素为高敏，对痢特灵、利福平、先锋VI耐药。木糖氧化产碱杆菌对氟苯尼的最低抑菌浓度（MIC）为8 IU/ML，对卡那霉素的最低抑菌浓度（M
3、IC ）为37 IU/ML，对庆大霉素的最低抑菌浓度（MIC）为 2 IU/ML，鲁氏耶而森氏菌形态A菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度（MIC）为4IU/ML ，对卡那霉素的最低抑菌浓度（MIC）为4 IU/ML，对庆大霉素的最低抑菌浓度（MIC）为1 IU/ML，鲁氏耶而森氏菌形态B菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度（MIC）为4 IU/ML，对卡那霉素的最低抑菌浓度（MIC）为2 IU/ML，对庆大霉素的最低抑菌浓度（MIC ）为0.5 IU/ML。关键词：水律蛇；致病菌；药敏实验；最小抑菌浓度水律蛇病原菌的药敏实验 1AbstractMouse snake, is a non-toxic and ec
4、onomic, are high medicinal value snake species, breeding mouse snake-effective, so more and more people choose to farming mouse snake and research mouse snake, the purpose of the experiments is timely control and treatment of the bacterial disease that highly contagious from mouse snake, and to redu
5、ce the harm caused by the disease, so we study of the disease, and do one set of susceptibility testing for the cause of the disease, in order to accurately targeted drugs, timely control and treatment of the disease, reduce losses, for this experiments， we get the bacteria from the blood to the hea
6、rt of the snake, by separation and purification ，we get three bacteria (Yersinia ruckeri tow Different forms; xylose oxidation Alcaligenes), experiment with a variety of antimicrobial agents by KB method these three pathogens drug sensitivity test with minimum inhibitory concentration tested and the
7、 results show that these three pathogens are of enoxacin, propiconazole send acid, amikacin, florfenicol test drugs for a very sensitive, high sensitivity of the Acetylspiramycin furazolidone, rifampicin, Pioneer VI resistance. Xylose oxidation Alcaligenes the Florfenicol minimum inhibitory concentr
8、ation (MIC) of 8 IU / ml of kanamycin minimum inhibitory concentration (MIC) of 37 IU / ml gentamicin minimum inhibitory concentration (MIC) of 2 IU / ml, Lus Jesus and Sen bacteria form A bacteria the minimum inhibitory concentration (MIC) of florfenicol 4IU/ML minimum inhibitory concentration of k
9、anamycin (MIC) of 4 IU / ml gentamicin minimum inhibitory concentration (MIC) of 1 IU / ml, Roots yeah and Sen bacteria form B bacteria florfenicol minimum inhibitory concentration (MIC ) 4 IU / ml kanamycin minimum inhibitory concentration (MIC) of 2 IU / ml gentamicin minimum inhibitory concentrat
10、ion (MIC) of 0.5 IU / ml.Keywords: Mouse snake; Pathogens; Susceptibility testing; Minimum inhibitory concentration (MIC)水律蛇病原菌的药敏实验 2目 录摘要.1Abstract .2目录.3前言.51 实验材料与实验方法.51.1实验材料.51.1.1病料获取.51.1.2培养基.51.1.3实验药品及试剂准备.61.1.4实验主要仪器.61.2实验设计与方法.61.2.1病菌的分离及纯化.61.2.2药敏实验.61.2.2.1实验准备.61.2.2.2试验步骤 .61.2
11、.3最小抑菌浓度试验.61.2.3.1 实验准备. .61.2.3.2试验步骤.72.结果与分析.82.1药敏试验结果与分析.82.2最小抑菌浓度试验结果与分析.103.讨论.123.1 兽医临床中的用药现状. 123.2 药敏试验的意义.12 3.3 水律蛇养殖的注意事项. .133.4 本实验所研究疾病的治疗建议. 13水律蛇病原菌的药敏实验 34.结论.13致谢.15参考文献.16附件.17水律蛇病原菌的药敏实验 4前 言水律蛇是一种非常常见的无毒蛇，是蛇酒的首选代表蛇之一，其肉具有祛风除湿、舒筋活络的药用功效，养殖水律蛇会带来很高的经济效益，所以养殖水律蛇的养殖户也越来越多，特别是广西
12、广东福建一带，水律蛇不仅用于药用，也是广西广东福建一带主要的食用蛇之一。但是，很多的疾病也会严重影响着水律蛇的存活率，给养殖户带来很大的损失，其中，有一种在水律蛇之间高度传染的疾病，该病传播速度快，发病急，可致使水律蛇心、肝、肺等重要器官发生严重的炎性反应，应急情况下给蛇用常用的抗生素治疗没有效果，很多养殖户此时会选择大量使用抗生素，一种抗生素不行就换另外一种，此方法不但导致抗生素大量滥用，还延误疫情的控制及治疗，加剧经济损失，要想及时控制疾病减少损失就必须要针对性的准确用药，抗生素是最常见也是最有效的抗菌药物，为了防止无目的滥用抗生素，我们对引起此病的致病菌用K-B纸片法做药物敏感试验从而确
13、定用药方案，针对性的治疗疾病达到控制疫情的作用，同时，再针对敏感药物做一组最小抑菌浓度（MIC）试验，确定致病菌的最小抑菌浓度，可为用药方案提供参考值。药敏试验目的在于检出细菌的耐药性，确定细菌的耐药药物与敏感药物，根据细菌的敏感药物有针对性地选择治疗药物，测出最小抑菌浓度便于给临床用药做指导。1试验材料与方法1.1试验材料1.1.1病料的获取解剖患病的水律蛇，用注射器刺进心包之内，从其心脏抽取一点心血液分离培养所得的分离纯化后的菌落，注意解剖的手术用具包括试验台都必须要进行消毒灭菌 1。1.1.2培养基普通肉汤培养基普通琼脂培养基水律蛇病原菌的药敏实验 5MH肉汤培养基MH琼脂平板培养基 2
14、1.1.3实验药品及药液准备头孢唑啉钠、氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素、生理盐水、无菌水、0.5麦氏比浊管、药敏纸片。1.1.4实验主要仪器接种针、接种环、酒精灯、涂布棒、巴氏滴管、1ml注射器、5ml注射器、37恒温箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分析天平等。1.2实验设计与方法1.2.1病菌的分离及纯化从病蛇体内抽取心血划线于普通琼脂平板培养基上，37培养24小时，观察菌落，然后挑取平板上的纯培养菌落，再进行划线分离，直到染色镜检确定已无污染后，再将这些纯化的细菌做系列1进行保种及做下一步实验 3。本步骤纯化获得三种不同的细菌（鲁氏耶而森氏菌的两种不同形态菌；木糖氧化产碱杆菌） 。1.2.2
15、药敏实验（K-B纸片法）(1)实验准备 用接种环沾取一点纯化后的系列1细菌，接种于MH肉汤培养液中，37培养1216 个小时，再用生理盐水将菌液调制为0.5麦氏（相当于1.5亿个细菌/ml）备用。(2)试验步骤 用无菌巴氏滴管吸取一管备用菌液滴3至4滴到MH琼脂平板培养基上，弃掉剩余菌液，取灭菌过的涂布棒，经酒精灯灭菌，在MH琼脂平板上均匀涂布，待35min室温干燥后，将相应的抗生素纸片平贴于涂布好的培养基上，37培养24小时 4，观察结果，注意一个平板贴4至5个纸片，且纸片之间要保持一定的距离，不能太过靠近，以免影响结果的记录。1.2.3最小抑菌浓度（MIC）试验(1)实验准备 本实验有三种
16、细菌，分别测试这三种细菌的最低抑菌浓度，先将这三种细菌接种到MH肉汤培养基中37培养24小时，再分别将三种细菌用生理盐水或肉汤稀释成0.5麦氏浊度备用，相当于1.5亿/ml的细菌量，实验用药有卡水律蛇病原菌的药敏实验 6那霉素64IU/ML、卡那霉素256IU/ML、氟苯尼考64IU/ML、庆大霉素64IU/ML和头孢唑啉钠64IU/ML四种药物，卡那霉素、氟苯尼考、庆大霉素都是根据前一步实验KB纸片法的结果选择的相应的敏感药物，此三样药物都是市面上容易买到的药物，头孢唑啉钠的选择是为了验证上一步实验KB纸片法中头孢纸片抑菌圈为0是否合理，若两实验结果相符则可以排除头孢药敏纸片药效失效的可能。
17、药物配制好后用高压蒸汽灭菌锅灭菌，再低温保存备用。本实验每种细菌做四种药，共有12组，每组9根试管，试管规格12*75，实验共用试管108根。(2)试验步骤本实验全部过程都在超净工作台操作，本实验的三种细菌分成A菌组(鲁氏耶而森氏菌A菌)B菌组(鲁氏耶而森氏菌B菌)，C菌组(木糖氧化产碱杆菌)三大组实验，每大组四种药物分别记为Q药F药K药T药。A组实验；将36支试管排成4行，每行各标上Q、F、K、T记号，每行9支试管，标上序号1至9号，在每一管中加入MH肉汤1ml，塞上胶塞，在Q行1号管中加入 1ml 64IU/ml的庆大霉素，混匀后吸取1ml到Q行2号管，混匀再吸1ml到Q行3号管，依次类推
18、至Q 行8号管，从Q行8号管吸1ml弃掉，Q行9号管不加药对照。再在Q 行1至9号管中分别加入0.1ml 0.5麦氏浊度的 A菌菌液，塞上胶塞，做好标记。F行、K 行、T 行依照Q行的方法相应加的64IU/ml的氟苯尼考、64IU/ml的卡那霉素、64IU/ml的头孢唑啉钠进行试验操作，加好后做好标记。B组与C组实验跟A组实验做法一样，B组用B菌试验，C 组用C 菌试验，其他步骤都同A组一样。全部加好后做好标记，37培养1620小时观察结果，如果结果试管变浑浊则说明长菌，该试管药物不能达到最低抑菌浓度，无法抑制细菌生长，如果试管依然清亮，则说明不长菌，该试管药物达到了最低抑菌浓度抑制了细菌的生
19、长 5。表 1 MIC 术式表管号药物浓度 iu/ml1322163844526170.580.259 0肉汤 ml庆大霉素 ml木糖氧化产碱杆菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml氟苯尼考 ml木糖氧化产碱杆菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1水律蛇病原菌的药敏实验 72结果与分析2.1药敏试验结果与分析根据中华人民共和国卫生行业标准纸片抗菌药物敏感试验标准WS/T 125-1999的规定标准，测药敏试验抑菌圈直径，所得实验数据如下：表2-1 WS/T 12
20、5-1999 肠杆菌科药敏试验判定标准抗菌药物及 纸片 抑菌环直径 相应的 MIC所测细菌名称 含量（ug） （最接近的完整 mm 数） （临界点，ug/ml） 耐药 R 中介 I 敏感 S 耐药R 敏感 S肉汤 ml卡那霉素 ml木糖氧化产碱杆菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml头孢唑啉 ml木糖氧化产碱杆菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml庆大霉素 ml鲁氏 A 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111
21、弃0.1 10.1肉汤 ml氟苯尼考 ml鲁氏 A 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml卡那霉素 ml鲁氏 A 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml头孢唑啉 ml鲁氏 A 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml庆大霉素 ml鲁氏 B 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml氟苯尼考 ml鲁氏 B 菌菌液110
22、.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml卡那霉素 ml鲁氏 B 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1肉汤 ml头孢唑啉 ml鲁氏 B 菌菌液110.1110.1110.1110.1110.1110.1110.111 弃0.1 10.1水律蛇病原菌的药敏实验 8氨基糖苷类丁胺卡那 30 17 32 10 500 15 8 18 25 10 测其他细菌 10 15 表2-2药敏试验判断结果 6 mm青霉素敏感标准 其他抗菌药物敏感标准抑菌环直径 敏感性 抑菌环直径 敏感性10
23、耐药 10 耐药1020 中度敏感 1115 中度敏感20 高度敏感 1520 高度敏感20 极敏表 3 三种细菌对 10 种抗菌药物敏感性的抑菌环直径及敏感性 mm药菌木糖氧化产碱杆菌 鲁氏耶而森氏菌形态 A 菌 鲁氏耶而森氏菌形态 B 菌抑菌圈直径 敏感性 抑菌圈直径 敏感性 抑菌圈直径 敏感性卡那霉素 13 中敏 25 极敏 22 极敏氟啶酸 27 极敏 25 极敏 26 极敏痢特灵 9 耐药 13 中 10 耐药丙环派酸 30 极敏 33 极敏 37 极敏乙酰螺旋霉素 18 高敏 23 极敏 26 极敏利福平 0 耐药 10 耐药 9 耐药先锋 VI 15 中敏 0 耐药 0 耐药丁胺卡那霉素 30 极敏 22 极敏 24 极敏氟苯尼考 24 极敏 26 极敏 31 极敏
