1、 目 录摘要1关键词1Abstract1Key words1引言11 材料与方法21.主要仪器和试剂21.1.1 主要仪器21.1.2 主要试剂21.1.3 主要试剂的配制31.2 实验方法31.2.1 枯草芽孢杆菌的分离31.2.2 染色体 DNA 的提取41.2.3 分光光度计检测 DNA 纯度41.2.4 DNA 的琼脂糖凝胶电泳52 结果与讨论52.1 菌株的鉴定结果52.2 分光光度计法检测结果与分析52.3 染色体 DNA 的琼脂糖凝胶电泳结果与分析52.4 关于 DNA 提取过程的讨论6参考文献7致谢 7枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的提取1枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的提取生物科
2、学专业学生 指导教师 摘要：从土壤中分离纯化并初步鉴定了一株枯草芽孢杆菌，用溶菌酶裂解该菌株，用蛋白酶 K 和 RNase A 分别水解去除蛋白质和 RNA，用分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度，做琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA 样品的质量。结果显示，从 50mL 菌液中提取出 10g DNA,并获得了较完整的琼脂糖凝胶电泳 DNA 条带。关键词：枯草芽孢杆菌, 染色体 DNA, 提取, 琼脂糖凝胶电泳The extraction of chromosomal DNA in Bacillus subtilisStudent majoring in Biology Science SongYan
3、hongTutor Sun XunAbstract：B acillus subtilis was isolated from soil and identified preliminarily .The strain was catalytically dissolved by lysozyme ,and the protein and RNA in the cell were hydrolytically removed by proteinase K and RNase A, respectively. The results showed that 10g of chromosomal
4、DNA of bacillus subtilis was extracted out from 50mL of the strain culture by spectrometry , and the DNA sample was complete through agarose gel electrophoresis .Key words：bacillus subtilis，chromosomal DNA，extraction，agarose gel electrophoresis引言 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835 年,Ehrenberg 所描述的 Vibrio subti
5、lis 即是现在大家熟悉的枯草芽孢杆菌,它是由 Cohn 于1872 年正式命名的, 现作为芽孢杆菌科 ( Bacillaceae) 的模式菌株 1。枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，从生物学特性来讲, 枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征, 其细胞呈直杆状。单个细胞0.7-0.82-3微米。着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.91.0-1.5微米。椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，微白色或微黄色，在液体菏泽学院本科生毕业设计（论文）2培
6、养基中生长时，常形成皱醭。可分解淀粉，为典型的好氧菌 2。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史, 早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来, 对枯草芽孢杆菌研究渐进到遗传学与分子生物学领域, 研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等 3-4。1997 年, Kunst F.等人首先完成了
7、枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定,并将结果发表在 Nature 杂志上 5。随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入开展,发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值 6。生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。从细菌、植物和哺乳动物细胞中提取基因组DNA可分两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的方法，去除蛋白质、RNA以及其他的大分子。掌握染色体DNA的提取方法，制备高质量的基因组DNA，可用作PCR扩增的模板，还可用于构建基因文库以及进行DNA印迹（Southern b
8、lotting)的材料。1 材料与方法1.1 主要仪器及试剂1.1.1 仪器 立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂） ；冰箱（海信北京电器有限公司） ；紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） ；恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂） ；高速冷冻离心机（美国 sigma 公司） ；分析天平(上海精天电子仪器有限公司） ；微波炉（合肥荣事达三洋电器股份有限公司） ；电泳仪 DYYIII5 型（北京六一仪器厂） ；水平板电泳槽（北京六一仪器厂） ；生化培养箱 HPS-160（哈尔滨东联电子技术公司） 、80mL 离心管和 2mL 离心管。1.1.2 主要试剂 TE 缓冲液、GTE 溶液、
9、10%SDS（m/v)、酚/氯仿/异戊醇=25:24:1，氯仿/异戊醇(24:1,体积比） 、预冷的 70%乙醇、预冷的无水乙醇、3mol/L 醋酸钠（pH5.2)、SC 溶液、4mol/L NaCl、溶菌酶（50mg/mL，新鲜配制） 、1mg/mL 溴枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的提取3化乙锭（EB),饱和酚、异丙醇、蛋白酶 K(10mg/mL） 、RNase A（1mg/mL） 、LB 液体培养基等。1.1.3 主要试剂的配制 1.1.3.1 饱和酚溶液 7取 100mL 新鲜酚倒入分液漏斗中，加 8-羟基喹啉至终浓溶度为0.1%（m/v),溶解混匀，此时溶液呈淡黄色，加入等体积的 0.
10、5mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，反复混匀后，静止分层，放出下层黄色酚液，弃上层；再加入 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液,0.2%的 -巯基乙醇溶液，重复上一步；直至下层酚相的 pH7.6-7.8；收集下层的黄色酚液，装于棕色试剂瓶中；加入少量 0.1mol/L Tris-HCl （pH8.0）覆盖在酚液的表面，置 4C 冰箱中保存。1.1.3.2 1M Tris-HCl 缓冲液(pH8.0)在 800mL 水中溶解 121.91g Tris 碱（三羟甲基氨基甲烷，分子量 121.14） ，加入浓盐酸，调 pH 至所需值，加水定容至 1L，分装后高压灭
11、菌。1.1.3.3 0.5M EDTA(pH8.0) 在 800mL 水中加入 186.1g 乙二胺四乙酸二钠（分子量 372.2）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节 pH 值至 8.0（约 20g)，然后定容到 1L,分装后高压灭菌。1.1.3.4 GTE 溶液50mmol/L 的葡萄糖、25mmol/L 的 Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L 的EDTA(pH8.0)。1.1.3.5 LB 液体培养基称取蛋白胨 2g,酵母膏 1g,NaCl 2g,蒸馏水 200mL，用 NaOH 调 pH7.2，分装到 4 个锥形瓶中，121C 灭菌 30min。1.2 实验方法1.
12、2.1 枯草芽孢杆菌的分离（1）配制培养基：配制 500mL 培养基，称取淀粉 10g、硫酸铵 1g、磷酸氢二钠 0.5g、酵母粉 0.25g、琼脂 10g。称量好后加去离子水定容到 500mL，分装到两个锥形瓶中，然后高压灭菌锅 121C 灭菌 30min，倒平板 8。（2）配制无菌水 200mL，121C 灭菌 30min 后备用；另包扎好培养皿，移液管，涂布棒等用品灭菌后，烘干备用。（3）制备土壤菌悬液：称取样品 5g（液体样品 5mL） ，放入装有 45mL 无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为 10-1的土壤稀释液。（4）取 45mL 无菌水 4 瓶，用记号笔编上 10-2，10
13、 -3，10 -4，10 -5。菏泽学院本科生毕业设计（论文）4（5）取 10-1稀释液，振荡后静止 2min，用无菌移液管吸取 5mL 上层细胞悬液加至装有 45mL 无菌水的试管中，制成 10-2稀释液。同法一次稀释至各浓度。（6）另取移液管，分别以无菌操作法吸取 10-5，10 -4，10 -3的稀释液0.1mL，加至制备好的平板上，用无菌刮刀（涂布棒）涂布均匀。（7）将培养皿倒置于恒温培养箱中，于 37C，培养 1-2 天。（8）根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应培养基的平板上划线，直至得到纯培养。然后对该菌落进行形态学以及生理生化反应（芽孢染色，革兰氏染色，淀粉酶水解反应
14、观察透明圈大小）鉴定，确定为枯草芽孢杆菌后，将菌株及时转接到斜面培养基上保存。1.2.2 染色体 DNA 的提取（1）挑取枯草芽孢杆菌菌株的 1 个菌落于装有 50mL LB 液体培养基的锥形瓶中，37C 振荡培养过夜（ 12-16h） 。（2）吸取 1mL 的过夜培养物于离心管中，10000r/min，离心 1min，收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀。（3）加入 100L GTE 溶液，混匀至彻底分散。（4）再加入 500L GTE 溶液，振荡混匀（注意不要残留细小菌块） 。（5）向悬液中加入 6L 的 50mg/mL 溶菌酶至终质量浓度为 1mg/mL，混匀，37C 温浴 40min。（6）
15、在向悬液中加入 6L 的蛋白酶 K 至终质量浓度为 0.1mg/mL，混匀，55C温浴 1h，中间轻缓颠倒微量离心管数次。（7）温浴结束后向溶液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（去除蛋白质和脂质） ，旋锅混匀，12000r/min，离心 5min,将上清液转移到另一 1.5mL 的微量离心管中，然后再用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（8）取上清液用等体积的氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（9）取上清液至新的离心管中，向上清液中加入 1/10 体积的 3mol/L 醋酸钠（pH5.2)，混匀，加入 2 倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20C 静置 30min沉淀 DNA，取出，4C，10000r/mi
16、n ，离心 10min9。（10）小心弃去上清液，用 1ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀，4C，10000r/min离心 5min。自然干燥除去乙醇。 （11）用含有 RNase A（至终质量浓度为 20g/mL)的 TE 溶解，37C 温浴40min，除去 RNA。（12）将样品贮存于 4C 冰箱中。枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的提取51.2.3 分光光度计检测 DNA 纯度 10取 30LDNA 样品，加 TE 缓冲液至 3mL，转入分光光度计的石英比色杯中；然后分光光度计也用 TE 缓冲液校正零点；在 260nm 和 280nm 分别读出光密度值，依据 OD260, OD280 以及 O
17、D260/OD280 的比值检测制备的总 DNA 样品的浓度和纯度。 1.2.4 DNA 的琼脂糖凝胶电泳（1）制胶：称取 0.4g 琼脂糖，加入 50mL 1TAE 缓冲液微波炉加热，冷却至 60C 时倒胶，凝胶凝固后 ,取出梳子，放入电泳槽中，并加入电泳缓冲液。（2）上样：取 10L,20L,30L DNA 样品与上样缓冲液混合，用移液枪将DNA 样品加入样品孔中。（3）电泳：接通电源，当溴酚蓝染料移动到适当位置处，停止电泳。（4）剥胶染色：将剥下的凝胶浸入溴化乙锭（EB,0.5g/mL)染色液中，室温染色 30min。然后在凝胶成像仪上观察并拍照。2 结果与讨论2.1 菌株的鉴定结果菌落
18、呈白色，边缘不规则，表面粗糙褶皱，不透明，黏稠杆状，产芽孢，长杆形；芽孢染色后，用油镜可观察到芽孢被染成绿色，菌体呈红色；革兰氏染色显微镜下观察到菌体呈蓝紫色，为阳性菌；淀粉酶水解反应时可观察到明显的水解圈。经过分离，纯化和初步鉴定，获得一株枯草芽孢杆菌，用于其染色体DNA的提取。2.2.分光光度计法检测结果与分析本论文用分光光度法检测所提枯草芽孢杆菌染色体 DNA 样品的浓度和纯度，结果见表 1。表 1 分光光度计测定结果OD260 OD280 OD260/OD280菏泽学院本科生毕业设计（论文）6从表 1 中可以看出，样品 DNA 的 OD260/OD280 的比值在 1.6-1.7 之间
19、，说明样品 DNA 的浓度纯度基本达到要求，但是此比值小于 1.8，说明样品中可能仍存在少许蛋白质或酚，这些杂质可能是导致比值偏低的原因。2.3 染色体 DNA 的琼脂糖凝胶电泳结果与分析 琼脂糖凝胶电泳可用于检测所提 DNA 样品的质量和大小，结果见图 1。1 2 3 Marker图 1 染色体 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱从图 1 中可以看出，经琼脂糖凝胶电泳后，样品 DNA 条带没有出现拖尾现象，说明所提 DNA 样品具有较好的完整性，可用做今后构建其基因文库的材料。2.4 关于 DNA 提取过程的讨论本实验从枯草芽孢杆菌中提取染色体 DNA，根据相关文献和实验指导书的提取方法，对枯草芽
20、孢杆菌染色体 DNA 进行了提取，先用溶菌酶对枯草芽孢杆菌1 0.156 0.093 1.6772 0.155 0.094 1.6493 0.156 0.094 1.6595000bp2000bp1000bp枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的提取7进行裂解，溶菌酶的处理是关键，在温浴中可以振荡混匀 23 次，如果细菌悬浊液变清，表明溶菌酶处理效果较好，否则需要补加溶菌酶，适当延长温浴时间；然后用酚、氯仿/异戊醇进行抽提（去除蛋白质，脂类等大分子物质） ，再加入醋酸钠、异丙醇沉淀 DNA；最后加入含有 RNase A 酶的 TE 缓冲液进行多次沉淀洗涤，以充分溶解附在管壁上的总 DNA，用加入的 T
21、E 缓冲液多次、反复地洗涤 DNA 沉淀所在部位时，操作要轻柔，以免快速吹吸导致剪切力过大使 DNA断裂。将经此方法提取出来的 DNA 用分光光度计测 260nm 和 280nm 处的光吸收值，并计算 OD260/OD280 的比值，若 OD260/OD280 的比值大于 1.8，说明仍存在RNA，则考虑用 RNA 酶处理样品；若小于 1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚、氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化 DNA。多次测量发现此比值均小于 1.6，说明提取的 DNA 中可能仍含有大量的蛋白质。原因可能是在 DNA 提取过程中操作时间长，导致某些试剂的 pH 及性质发生了变化，而且纯化步骤少，所以
22、未能达到理想的纯化效果，提取的 DNA 纯度不符合要求。在进行第二次提取之前，将所有试剂都进行重新配制，并重调 pH，加入溶菌酶后并延长温浴时间，更好的裂解枯草芽孢杆菌；为了将蛋白质去除干净，加入了蛋白酶 K，并增加了饱和酚的抽提次数。在沉淀 DNA 时，将醋酸钠溶液，无水乙醇，70%乙醇放入-20C 冰箱中预冷，并将 DNA 放入-20C 冰箱30min，增强 DNA 沉淀效果。然后将取出来的 DNA 用分光光度计测 260nm 和280nm 处的光吸收值，并计算 OD260/OD280 的比值，多次测量此比值均大于1.6，说明 DNA 样品中蛋白质等大分子物质已基本除尽，所提取 DNA 的
23、纯度符合要求。参考文献1 刘志恒. 现代微生物学M. 北京:科学出版社, 2002.p92-99.2 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册M.北京:科学出版社, 2001.3 王红革.地衣芽孢杆菌淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达J.微生物学报,1997.37(2):101-106.4 冯清平,薛林贵.复合诱变原生质体选育耐热碱菌J.微生物学 报,1996.36(6):30-32.5 KUNST F, OGASAWARA N, MOSZER L, et al. The complete genome sequence 菏泽学院本科生毕业设计（论文）8Of the Gram positiv
24、e bacterium Bacillus subtilisJ. Nature,1997, 390: 249-256.6 惠明，窦丽娜 . 枯草芽孢杆菌的研究进展 J. 微生物学报，2008,36(27): 623-624.7 卢圣栋.现代分子生物学实验技术(第二版)M.中国协和医科大学出版社，1999.p66-67.8 沈萍 , 陈向东 . 微生物学实验教程第四版M.高等教育出版社， 2007.p151-152.9 朱旭芬. 基因工程实验指导第二版M. 高等教育出版社，2010.p28-31.10 . 环状芽孢杆菌的分离鉴定和分子生物学特性的初步研究 . 四川大学硕士论文, 1992.p8-9
25、.致谢本毕业论文实验工作是在菏泽学院生命科学系 教授悉心指导和严格要求下完成的。孙老师严谨的治学态度、执着的科研精神、渊博的专业知识给我以深刻的教诲和指导，让我受益匪浅。他为我们提供了很多相关的实验资料，同时也帮助我们解决了很多在实验中遇到的难题。在他的指导下，使我在巩固自己的专业知识的同时也意识到了自己的不足。在论文完成之际，向敬爱的孙老师致以最衷心的感谢！实验期间和同实验室的同学共同度过，大家相互帮助，相互关心，相互学习，维持了一个很好的学习氛围和实验环境，使这次毕业论文的实验得以顺利完成，尤其是王鑫晔和陈德世同学，他们在此期间给予我的无私帮助和大力支持与鼓励。在此表示深深地谢意。在菏泽学院生命科学系所有老师的关心和指导下，我度过了生命中最重要的四年，感谢他们四年来对我的培养和教育！
