1、烟台大学文经学院毕业论文任务书系（部）：食品与生物工程系姓名 学号 毕业届别 2014 专业 食品科学与工程毕业论文（设计）题目 烟台樱桃果园土壤中酵母菌株的相关耐受性研究指导教师 学历 本科 职称 副教授 所学专 业 食品科学与工程具体要求(主要内容、基本要求、主要参考资料等)：主要内容：从烟台地区土壤中采集选育出优秀野生酿酒酵母菌株，测定其耐受性并得出最适合酵母菌发酵的环境（酒精度、糖度和渗透压）。基本要求：熟练掌握酵母菌的培养、菌悬液的制作、YPD 液体培养基的配制、酵母菌的接种、酵母菌的发酵能力测试和酵母菌相关耐受性测定的实验操作。主要参考文献：1 杨建刚,马跃 ,肖冬光,星野力. 酿
2、酒酵母酒精耐受性研究进展J. 酿酒科技.2006(11).2 E. S. Naumova, M. V. Zholudeva, N. N. Martynenko, The Molecular Genetic Differentiation of Cultured Saccharomyces StrainsJ.Microbiology,2005,74(2):179187.严格按照烟台大学文经学院关于毕业论文（设计）写作规范细则要求撰写毕业论文。进度安排：1、第 1-3 周 收集资料、查阅文献。2、第 4-7 周 熟练掌握酵母菌培养、制作 YPD 培养基和划线培养的操作步骤。3、第8-13 周 测试
3、酵母菌在高糖环境、高渗透压环境以及酒精环境下的生长状况，通过其产气情况判定其耐受性。4、第14周 论文初稿。5、第15周 论文修改及定稿。指导教师（签字）： 年 月 日系部、院（系）意见： 教学院长签字： 年 月 日备注：烟台樱桃果园土壤中酵母菌株的相关耐受性研究摘要 从烟台当地的樱桃果园园区土壤中分离纯化出优质野生酿酒酵母菌Y7、Y24、Y27、F2、F6、F7 ，并对其进行相关耐受性的研究， 最终得出野生酿酒酵母普遍能耐受 20%糖环境，6%和 8%酒精环境以及 7%和 9%渗透压环境；所有菌株均不能在高于 60%糖浓度下生长，不能在高于 16%酒精浓度下生长。在酿酒时可以控制这些变量，在
4、一定程度上提高酒的感官质量。关键词：耐受性；土壤；野生酵母； Research on Tolerance of Yeast Strain Cherry Orchard Soil in YantaiAbstracts: The purified wild Saccharomyces cerevisiae Y7, Y24, Y27, F2, F6, F7 were isolated from Cherry Orchard Park in Yantai in the local area, Research and related tolerance on it finally found yeas
5、t generally can tolerate 20% glucose,6% to 8% alcohol and 7% to 9% osmotic environment. When vintage can control these variables to improve the sensory quality of the wine.Key words: Tolerance;Soil;Wild yeast目录1 前言 .11.1 酵母菌 .11.1.1 酵母菌基本特征 .11.2 酵母菌的历史概况及发展趋势 .21.3 酵母菌分类研究 .21.3.1 酵母菌的分类依据 .21.3.2
6、普通酿酒酵母菌选种指标 .31.4 立题背景和意义 .32 材料与方法 .52.1 材料 .52.1.1 酵母菌 .52.1.2 培养基 .52.1.3 试剂 .52.1.4 实验仪器 .52.2 方法 .62.2.1 酵母菌的培养 .62.2.2 酵母菌的发酵能力测试 .62.2.3 酵母菌耐受性测试 .63 结果与讨论 .83.1 酵母菌的筛选 .83.2 酵母菌的耐受性测定 .103.2.1 高糖环境耐受性测定 .103.2.2 酒精环境耐受性测定 .133.2.3 高渗透压破环境耐受性测定 .15结论 .16展望 .17参考文献 .18致谢 .191 前言1.1 酵母菌酵母菌是一种单细
7、胞真菌，在有氧和无氧的环境下都能生存，属于兼性厌氧菌。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。酵母菌的无氧呼吸方程式：C6H12O6（酶）2C 2H5OH（酒精）+2CO 2 +少量能量图 1-1 显微镜观察酵母菌1.1.1 酵母菌基本特征1.1.1.1 形态特点酵母菌属真菌界（Fungi） 、子囊菌门（Ascomycota） 、酵母亚（Saccharomycotina） 、酵母纲（ Saccharomycetes） 、酵母目（Saccharomycetales） 、酵母科（Saccharomycetaceae ） 、酵母属（Saccharomyces
8、 ） 1。1.1.1.2 形态特点酵母细胞明显比大多数细菌大，细胞大小约为 25530m(短轴长轴)。酵母多数为单细胞生物，常呈卵圆形或者圆柱形。实际上，每种酵母都具有自己特有的形态模式，但会随着菌龄与环境不断变化。一般平板培养基上的酵母菌落呈白色凸起粒状，常带有酒香味。酵母属于真核微生物，在细胞结构上除没有鞭毛外，一般都具有细胞壁、细胞膜、线粒体、核糖体、液泡等细胞器。1.1.1.3 营养与生长酵母菌广泛生存于潮湿且富含糖分的物体表层，如果皮表层、土壤、植物表面、植物分泌物（如仙人掌的汁） ，甚至在空气中也有分布。此外，有研究发现酵母菌还能寄生于人类身上与一些昆虫肠道内。酵母菌属于化能异养、
9、性厌氧型微生物，能够直接吸收利用多种单糖分子，比如葡萄糖，果糖等。 酵母菌不能直接利用淀粉等多糖类物质，因此，在酒的酿制过程中，原料必须经过糖化才能被酿酒酵母进一步发酵利用 3。1.1.1.4 生殖方式酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子，在条件适合时再萌发。一些酵母，如假丝酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无性繁殖 4。1.2 酵母菌的历史概况及发展趋势4000 年前，古埃及人就已经开始利用酵母酿酒与制作面包了；中国的殷商时
10、期(约 3500 年前 )，古人利用酵母酿造米酒，而酵母制作馒头、饼等开始于汉朝时期。1680 年, 荷兰科学家雷文霍克首次利用显微镜观察到酵母，但当时并没有将其当作一个生物体看待。1857 年，法国科学家 路易巴斯德首次发现酿造酒精来之酵母体的发酵作用，而并非简单的化学催化。巴斯德曾经将空气通进酿酒液中，发现酵母的细胞数量有明显的增加，但是酒精的生成量出现减少的状况，后来人们将此现象称为“巴斯德效应”。人们利用纯培养的酵母菌生产酒已经有一个世纪的历史，酿酒生产中使用的酵母多种多样，各具特色。突变、杂交和 DNA 重组在酿酒酵母育种工作中也取得了广泛的应用 5。在现代社会，酒的生产和消费更加强
11、调个性化，人们的目的已经不仅仅是要安全迅速地将果汁中的糖完全转化为酒精，而是要求得到风格各异的商品化产品。因此，人们从当地野生酵母的生理生化、分子生物学及生产应用等各方面对酵母进行更细致全面的研究，以期达到改善酒产品风味的目的。1.3 酵母菌分类研究1.3.1 酵母菌的分类依据1.3.1.1 形态学依据观察酵母菌的无性繁殖方式、有性繁殖方式、假菌丝、掷孢子的形成和培养特征时，要想得到正确判断，必须进行各种特殊培养。如果试验不充分，培养时间不够都会造成错误的结果。（1）细胞学形态 酵母菌细胞的形态学特征包括无性繁殖方式，细胞形态和大小，这是分类学上区分种属的主要依据。酵母菌的无性繁殖方式主要为芽
12、殖，个别裂殖。酿酒酵母菌为多端出芽繁殖。有无芽孢是酵母鉴定的重要依据之一。（2）培养特征 酵母菌的培养（包括液体培养和固体培养）特征也是重要的分类学指标 6。（3）子囊孢子的形成和形态 酵母菌有性繁殖方式主要是形成子囊孢子。酵母菌是否形成子囊孢子在酵母分类学占有首要地位，它能决定性地将酵母菌划分为产孢酵母和无孢子酵母。但是，只依据是否产子囊孢子还不能定属，还需要结合形态和生理指标 7。（4）假菌丝的形成和形态 酵母菌分类除根据细胞形态外，还要观察其真菌丝、假菌丝的情况。有无菌丝也是酵母鉴定的重要依据之一。1.3.2 普通酿酒酵母菌选种指标随着对酵母代谢特性的深入研究及发酵分析手段的进步，现在对
13、酵母筛选标准更加细化，分述如下：（1）快速启动发酵：优选酵母的重要性状之一是能够快速启动酒精发酵。酒精发酵启动前野生酵母、细菌、霉菌的生长和代谢旺盛，通常会造成酒的风味缺陷甚至发酵迟滞。如果接种优选酵母，就能够在短时间内启动酒精发酵，从而避免这些问题8。（2）对于酒精的耐受性：在大多数情况下，酿酒工艺要求果汁中的糖分能够被完全发酵。如果酵母菌的酒精耐受性不高，就有可能造成酒精发酵中途停止，选择酒精耐受性高的菌种有助于解决这一问题。（3）对于 SO2 的耐受性：除梗破碎后的醪液，通常都需要添加一定量的 SO2，主要目的之一是抑制野生酵母和败坏细菌的生长，这就要求优选酵母能够耐受一定浓度的 SO2
14、，从而在启动发酵中占据优势 9，避免杂菌对发酵过程的不良影响。（4）对于低温的耐受性：酒的风味化合物在室温条件下比较容易挥发。在这些化合物中，许多为酯类、萜烯类或醛类物质等，它们赋予了酒花香和水果香味，同时在正常的发酵温度范围内，发酵温度越低，风味物质的损失越少。所以对于优质酒的酿造而言，低温发酵尤为重要。（5）产生最少的不良副产物：代谢不良副产物如硫醇、硫化氢、二氧化硫和乙醛的形成能力常与酵母本身的遗传特性有关。因此，筛选酵母时应选择不良副产物尽可能少的菌株。（8）良好的风味物质形成能力：酵母的风味形成能力根据酒风格的不同而有所差异。酵母菌在发酵过程及发酵完成后的自溶过程，来自酵母降解产生的
15、许多大分子物质，如氨基酸、蛋白质、多糖、核酸衍生物及类脂等在酵母自溶过程中释放到酒里，这些成分中，有些对起泡酒的口感、香气、风味和泡沬的质量都有积极的影响 10。（9）转化效率：优良的酿酒酵母要求它能够最大限度地将浆果中的糖充分转化为酒精。在冷凉地区，浆果的含糖量不足，选择酒精发酵转化率高的酵母对于提高酒体丰满度，所以降低酒中杂醇油的含量具有重要意义。1.4 立题背景和意义现代酒生产工艺一般采用纯种培养的酵母菌株进行发酵，酵母菌性能的优劣与酒的生产和成品的质量密切相关。酿酒酵母是酿酒工业发酵最主要的酵母菌。优良的酿酒用酵母菌株必须具备以下性能：含有的酒化酶强，发酵能力强；生长速度快，繁殖能力强
16、，抗杂菌的能力强；具有较强的耐性，包括耐高糖、耐酒精、耐渗透压；酿成的酒风味佳等 11。优质酒的生产迫切需要具有产区特征、能体现酒特色和风格的优良酵母菌种。对我国本土酵母菌资源的研究是酵母菌种选种、育种的基础。在传统的樱桃和樱桃酒产区，酵母菌逐渐适应了当地的气候、土壤和樱桃品种，再加上自然选择的作用，形成了适应当地樱桃酒的菌系，樱桃园的周边环境都为酵母菌的繁衍提供了理想环境，附在成熟樱桃浆果上的酵母以细胞或抱子的形式进入土壤上层。已有研究表明园区的土壤和空气都有酵母菌的大量存在，从中可以筛选到优良酵母菌种。所以，传统樱桃园酿出的美酒，具有很强的甚至独一无二的地方特性。通过对地方樱桃果园土壤中酵
17、母菌株的相关耐受性进行研究，可以很好地筛选优质酿酒酵母菌，从而进行推广。同时酒的香气是评判酒品质一个重要的感官指标，芳香物质也是构成酒的重要成分 12。酵母菌种对酒的香气起着重要的作用。充分利用酿酒酵母自身的优点及其与其他酿酒酵母酵母间有益的相互作用 13，进行混和接种发酵，能够有效地改善酒的感官质量。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 酵母菌 从烟台本地樱桃果园土壤中采集筛选并纯化出的酵母菌，由南 415 实验室冷藏保存。2.1.2 培养基 YPD 固体培养基：1000mL 的 YPD 固体培养基含有 10g 酵母浸粉，20g 的蛋白胨，20g 的葡萄糖，30g 的琼脂粉，121灭菌 20
18、min。用于酵母菌的分离纯化，感染平板以及菌悬液的制作。YPD 液体培养基：1000mL 的 YPD 液体培养基含有 10g 酵母浸粉，20g 的蛋白胨，20g 的葡萄糖，121 灭菌 20min。用于酵母菌菌悬液的制作以及耐受性的测试。WL 培养基：1000mL 的 WL 培养基含有 5g 酵母浸粉，5g 酸水解酪蛋白，50g 葡萄糖，磷酸二氢钾 0.55g，氯化钾 0.425g，氯化钙 0.125g，硫酸镁 0.125g，氯化铁0.0025g，硫酸锰 0.0025g，溴甲酚绿 0.022g，琼脂 17g，调节 pH 至 5.5，121 灭菌20min。用于酿酒酵母的筛选。2.1.3 试剂
19、0.9%生理盐水：300mL 去离子水，2.7g NaCl，现用现配。无菌水：去离子水 121灭菌 20min，现用现配。95%无水乙醇，葡萄糖，酵母浸粉，蛋白胨，琼脂粉，酸水解酪蛋白，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙，硫酸镁，氯化铁，硫酸锰，溴甲酚绿，浓缩苹果汁。2.1.4 实验仪器表 2-1：所需实验仪器清单Table 2-1: The list of the necessary experimental equipment仪器名称 规格 生产厂家电子天平 HZY-200-A 福州华志科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器 YXQLS75S11上海博讯实业有限公司医疗设备厂恒温培养箱 HZQQG 东
20、联电子技术开发有限公司冰箱 BC/BD203HC 海尔股份有限公司生物净化工作台 BCM-1000 苏州净化设备有限公司显微镜 TOKYO 日本奥林巴斯有限公司DM 型直热电热套 DM 山东鄄城华鲁仪器公司无菌操作台 SWCJIFD 苏州净化设备有限公司2.2 方法2.2.1 酵母菌的培养2.2.1.1 酵母菌平板的制备将酵母菌从斜面用接种坏挑取单菌落，划线接种到 YPD 固体培养基上，置于28培养箱中培养 24h，备用。2.2.2 酵母菌的发酵能力测试2.2.2.1 培养液的制备将 10mL 移液管，锥形瓶，小烧杯，杜氏小管（杜氏小管放在装有水的烧杯中，使灭菌后管内没有气泡）灭菌，冷却至室温
21、后备用。用 10mL 移液管转移 10mL 浓缩苹果汁至的锥形瓶中，加入 60mL 无菌水，混合均匀后转移至小试管中，放入管内无气泡的杜氏小管，扣严塞子，贴好标签备用。2.2.2.2 酵母菌发酵能力测试将酵母菌从平板用接种坏挑取单菌落，接种到配制好的苹果汁培养液中，置于28培养箱中培养，隔 8h 观察一次产气情况并记录。2.2.3 酵母菌耐受性测试2.2.3.1 酵母菌的筛选通过酵母菌的发酵能力测试情况，筛选出起发时间短，发酵速度快的菌种，划线接种到 YPD 固体培养基上，置于 28培养箱中培养 24h，备用。2.2.3.2 酒精耐受性测定配置 YPD 液体培养液，加热使溶解均匀后冷却至室温，
22、用 10mL 移液管转移到小试管中，放入杜氏小管，盖严塞子，121灭菌 20min，冷却至室温后，按6%、8%、10%、12%、14% 、16%（v/v）的浓度加入酒精，混匀后接入酵母菌，置于 28培养箱中培养，隔 8h 观察一次产气情况并记录，以生长状况表征其对不同浓度酒精的耐受性 14。2.2.3.3 葡萄糖耐受性测定配置不含糖的 YPD 液体培养液，用 10mL 移液管转移到小试管中，按20%、 30%、 40%、50%、 60%、70%（g/mL）的浓度加入葡萄糖，加热使溶解均匀后放入杜氏小管，盖严塞子，121灭菌 20min，冷却至室温，混匀后接入酵母菌，置于 28培养箱中培养，隔 8h 观察一次产气情况并记录，以生长状况表征其对不同浓度糖的耐受性。2.2.3.4 渗透压迫耐受性测定配置 YPD 液体培养液，用 10mL 移液管转移到小试管中，按7%、9%、11%、13%、15% 、17%（g/mL）的浓度加入氯化钾，加热使溶解均匀后冷却至室温，放入杜氏小管，盖严塞子，121灭菌 20min，冷却至室温，混匀后接
