1、 西南科技大学本科生毕业论文 紫穗槐 Amorfrutin 的提取与分析摘要：Amorfrutin 是一种具有抗癌活性的苯基类化合物，且具有一定的抗糖尿病效应。这种天然活性物质不仅具有降血糖、抗炎症的功效，还具有很好的耐受性。 Amorfrutin 及其类似物还可以预防脂肪肝- 一种因过量高脂营养引起的常见病，而且可被用作功能性的营养补剂或作为为患者量身定制的温和性治疗药物成分。Amorfrutin 最早发现于原产于北美的甘草及紫穗槐果实里，而对于国内紫穗槐是否也含有这种天然产物，则需要进一步研究。本实验对国内引进栽培的紫穗槐的果实里是否含有 Amorfrutin 这种物质进行了探究。根据文献
2、调研，采取溶剂萃取法，用无水乙醇对紫穗槐果实中的化学物质进行提取后，通过液相质谱联用法对萃取液成分进行分析鉴定，得到提取物的质谱图，证实了提取物中确实含有 Amorfrutin。然后改变实验条件及提取工艺，先将紫穗槐果实用 5%的盐酸和氯仿进行萃取，再经石油醚和甲醇萃取，经液相质谱联用分析，在甲醇相中得到了 Amorfrutin 的谱图。最后再将两次不同结果图谱的质荷比和相对丰度进行对比，证实对比实验中经萃取处理后的紫穗槐果实中提取到更多的 Amorfrutin，初步找到提取紫穗槐果实里Amorfrutin 最优工艺。关键词：天然产物；紫穗槐；萃取；Amorfrutin；糖尿病西南科技大学本科
3、生毕业论文 The extraction and analyses of Amofrutin from Amorpha fruticosaAbstract: Amorfrutin as an anti-cancer activity of phenyl compound, has a certain anti-diabetic effects. According the world latest discovery, this natural active substance with hypoglycemic, anti-inflammatory effect, also has good
4、 resistance effect at the same time. Amorfrutin and its analogues can also prevent fatty liver, a common disease caused by the excessive of fat nutrition. And it can also be used as functional nutritional supplements or a mild treatment to the patients. The natural substance Amorfrutin was first dis
5、covered in the plant of licorice, and then in the seed of Amopha fruticosa with its effect of ant-diabetic. But it still need further study to make sure whether the domestic Amorpha has the Amorfrutin or not. In this paper, we studied this issue. We use the solvent extraction in the anhydrous ethano
6、l to extract Amorfrutin from the seed of Amorpha, and then washed with hydrochloric (5%) acid and methanol. By using liquid phase chromatography to appraise the Amorpha, we find it contains Amorfrutin in the solution after ethanol extraction. After comparing different extraction techniques and the m
7、ass change ratio, relative abundance, we initially get the method of extraction Amorfrutin from the Amorpha.Key words: natural products, Amopha fruticosa, extraction, Amorfrutin， diabetes mellitus 西南科技大学本科生毕业论文 1目 录第 1 章 绪 论 .11.1 研究背景 .21.1.1 紫穗槐果实中化学成分的研究 .31.1.2 天然活性物质提取方法 .31.2 物质鉴定及分析方法 .51.2.1
8、 液质联用法 .51.2.2 硅胶层析法 .61.2.3 液相色谱法 .71.3 紫穗槐果实的化学成分和 Amofrutin 的研究现状 .91.4 实验目的和意义 .10第 2 章 紫穗槐果实里 Amorfrutin 的提取 .112.1 实验仪器装置和试剂 .112.1.1 实验仪器 .112.1.2 实验装置 .112.2 实验试剂 .122.3 实验原理 .12第 3 章 结果与讨论 .13.1 方案一结果 .23.2 方案二结果 .33.3 方案三结果 .33.4 讨论 .5第 4 章 结论 .12致谢 .25参考文献 .26西南科技大学本科生毕业论文 2第 1 章 绪 论1.1 研
9、究背景 紫穗槐为豆科紫穗槐属多年生落叶灌木。在世界范围内具有广泛的分布。紫穗槐属植物全世界约25种，原产北美，我国引入栽培的只有紫穗槐一种，南北均有栽植，紫穗槐在我国又称绵槐、油条、椒条、穗花槐、紫翠槐、苕条。临床上单方应用，“治烧烫伤，痈疮，湿疹”。 多年生豆科落叶小乔木, 原产北美洲， 多作为水土保持树种, 其枝条可用于编织，叶子可作绿肥，其根、茎、叶可作药用。其挥发油是一种理想的天然香料，具有止痒驱蚊的功能，紫槐的这些重要用途，已经引起人们的广泛关注，近几年来国内已经开始有紫穗槐种子为原料的产品生产 。 之前国内外的科学家对紫穗槐果实里的化学成分进行研究，发现紫穗槐果实里含有丰富的有机化
10、合物，主要为黄酮类化合物以及一些挥发油的成分。有医学研究发现，紫穗槐果实里的黄酮类化合物具有一定的抗癌活性。天然产物活性成分(功能因子)具有特定的功效 15。通过体内外试验和临床验证证明了它们具有抗氧化、抗衰老、抗菌消炎、抗癌、提高免疫力、降血脂、降血压、降血糖等功效。目前，国内外对天然产物活性物质进行了全方位和多领域的研究，研究其原料及原料的栽培和培养技术，以期获得高含量活性成分的原料，研究天然产物的提取分离制备技术、活性物质的构成与结构、功效和机理等，方兴未艾。研究的主要目的和实际的应用在于开发生产功能保健食品、添加剂或药品。天然产物的提取分离制备技术，传统方法主要是溶剂萃取，如热水浸提、
11、碱液提取和醇类提取等。其它溶剂的考察主要集中在如丙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯 氯仿、正丁醇等有机溶剂对活性物质的提取上。近年来，人们在传统方法的基础上采用了微波、超声波物理助提技术和酶分解等生物技术来提高提取率。大多数活性物质的粗提物中活性物质含量偏低，为了得到高含量和高纯度的产品必须进行精制，根据天然产物的性质常用精制方法有：沉淀剂法、层析技术、超临界C02萃取技术、膜分离技术。层析技术，包括吸附层析法、柱层析法、薄层层析法(TLC)、纸层析法、气一液层析法、升华法和高效液相层析法(HPLC)等。工业化生产中常用的是柱层析，常见的吸附剂有：硅胶、硅藻主、氧化镁、氧化铝、纤维素、聚酰胺、分西南科技
12、大学本科生毕业论文 3子筛和离子交换树脂等，应用广泛的主要为聚酰胺，大孔树脂等吸附剂。超临界C02萃取技术，超临界流体C02是萃取小分子、低极性、亲脂性物质的理想溶剂。超临界流体萃取技术与传统提取方法相比具有萃取时间短、效率高、高选择性提取、工艺流程简化、低温操作、适于对热敏性物质提取、无溶剂残留、安全无毒、可实现有效成分的快速、准确分析等优点。膜分离技术，用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。对于提取的活性物质，尤其是未知结构的物质要进行鉴定，主要方法有：纸色一紫外及可见光谱分析；高效液相色谱(HPLC)一质谱分析(
13、MS)；核磁共振波谱法(NMR)；X一衍射法等。1.1.1 紫穗槐果实里化学成分的研究Amorfrutin先后被发现于甘草及紫穗槐的果实的提取物中，其具有很好的抗炎效果，并在后期的实验中在小鼠身上进行了实验验证 9。科学家们对甘草的研究提取也验证了其具有抗糖尿病效应，不仅可以降低血糖，还能抗炎，且耐受性极好。此外，Amorfrutin及其类似物还可以预防脂肪肝一种因过量高脂营养引起的常见病。紫穗槐果实中的Amorfrutin提取物有如此重要的功效，对其研究势在必行，而可能在提取方法等方面的技术不成熟，可能引起提取的化合物不纯或者提取量不多，这个时候，如果能在实验室人工合成Amorfrutin，
14、通过不断实验来验证能否得到较高产率的物质，则可选取相应的方法来进行大规模的投入生产。Amorfrutin可被用作功能性的营养补剂或作为为患者量身定制的温和性治疗 8。鉴于糖尿病等代谢性疾病的迅速蔓延，我们的目的是进一步开发这些物质以在未来用于人体。为了这一目标，研究人员必须在对糖尿病患者的临床研究中检测这些物质和植物Amorfrutin提取物的效应。目前国内外实验室对紫穗槐果实里的化学成分进行多种研究。有研究用活性跟踪法从紫穗槐叶中分离出有效混合物,经薄层制备,分离出4种化合物纯品。经鉴定分别为-脱氢-灰叶酚；脱氢-鱼藤素-灰叶素；脱氢-灰叶酚。对大皱鳃金龟甲的试验表明,这些化合物中的任何一种
15、,单独给药时,均不具有明显的杀虫效果,但以一定的比例混合后用药, 则表现出理想的杀虫效果，可能是协同作用的结果 15。采用GCMS对紫穗槐果实中挥发油成分进行分析的方法：用挥发油提取器对紫穗槐果实中的挥发油进行了提取和测定。采用30m X0.25lnln弹性石英毛细管柱，ND检测器，结合GC-MS ，对挥发油进行了分析。得到结论是：紫穗槐果实挥发油含量是西南科技大学本科生毕业论文 421，从中分离出30个化合物，鉴定了其中的26个成分，并测定了相对含量，其主要成分为大牦牛儿烯(11.40)、13一蒎烯(5.85) 、蒈烯一3(302)、古巴烯(5.84 )、石竹烯(8.40 ) 、奥(4.49
16、) 、D一伪一旺雪松烯(4.53)、l，3，3一三甲基一2,2,1.02,6 三环已烷(13.63) 26。1.1.2 天然产物提取工艺与方法近年来，随着人们对天然产物的药用和营养价值认识的逐步深入，世界范围内掀起了天然产物中活性成分研究的热潮，国家自然科学基金资助项目中就有多项是关于此课题的研究，然而天然产物的成分十分复杂且有些物质含量甚微， 提取时又要求活性成分不能被破坏，溶剂萃取等传统提取方法已远远不能满足对天然产物进行深入研究的需要。如何快速，有效地将活性成分提取出来以及对提取物的进一步分离纯化已成为天然产物研究的瓶颈,特别是近年来人们环保意识的迅速提高和国家可持续发展战略的施行，更使
17、得开发新的天然产物提取技术成为大势所趋。目前，科学工作者在对传统方法进一步改善的同时，又发展出了多种新的提取技术 7。对天然产物中活性成分进行提取，最常用的是溶剂萃取法，所用溶剂包括水和有机溶剂，水能够溶出的成分较多，导致后处理困难，有机溶剂分亲水性和亲脂性两种，选择性好，但挥发性大且一般有毒，提取方法主要有浸渍、渗漉、煎煮、回流和连续提取，浸渍和渗漉简单易行。一般在常温或温热条件下操作适于热不稳定成分的提取但溶剂消耗量大、费时长、提取效果差。水煎煮法是我国最早使用的传统方法，大部分成分可被不同程度的煎出但具有挥发性以及遇热易破坏的成分不宜用此法。用易挥发的有机溶剂加热提取则需采用回流法。为了
18、弥补回流提取中溶剂消耗量大，操作麻烦的不足，可采用连续提取，又称索氏提取法。这是溶剂萃取中最常使用的方法，提取效率较高但提取液受热时间长，热不稳定成分易分解 42。近来发展的自动索氏提取将高温渗漉与常规索氏提取相结合。溶剂用量比常规索氏提取少一半，且所需时间大幅度缩短。水蒸气蒸馏也是一种常用的提取方法。被提取的成分应具备以下条件，具有挥发性、沸腾期间与水长时间共存而不发生化学变化、难溶或不溶于水。显而易见上述传统方法具有许多缺点:1.大量使用有机溶剂产生的废液废渣严重污染环境且不可避免的溶剂残留会影响产物的质量和稳定性。2.提取效率低，步骤多，选择性差，较难实现自动化或联用提取。西南科技大学本
19、科生毕业论文 53.温度高，时间长,。使得能耗大且易造成热敏性成分分解和挥发性成分损失。因此，发展快速、高效、尽量不用或少用有害试剂、将环境污染减到最低限度的绿色样品处理技术已成为该领域科学工作者追求的目标。超临界流体萃取法是近二、三十年来迅速发展起来的一项新技术 42。目前，在我国主要用于天然产物中有效成分的提取。超临界流体是指处于临界温度和临界压力以上的既非气态又非液态的物质，它兼有液体和气体的优点。其密度与液体接近，而密度与溶解能力基本成正比，所以它和液体一样，很容易溶解其它物质。同时，它的粘度和表面张力很小，只是略高于气体。这使得溶质在其中的扩散系数要比在液体中大得多，在临界点附近超临
20、界流体的温度和压力发生微小变化即可导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。根据这一特性9可通过控制体系的温度和压力，使各种待萃取组分按它们在超临界流体中的溶解度大小先后提取出来。并得到初步分离最常用的超临界流体。它的化学性质不活泼、无毒无味、价格适中且具有较低的临界温度和临界压力，是萃取小分子、低极性、亲脂性物质的理想溶剂。但对于糖苷，多萜等极性或大分子化合物则显得无能为力。加入极性改性剂可使CO2的溶解性和选择性得以改善。但如何将超临界流体萃取的应用范围扩大到极性甚至离子型物质仍是该技术今后发展的重要方向之一 42。在对紫穗槐果实里化学成分进行提取和分离时，一般采用硅胶柱层析，高速逆流色谱法等
21、方法对紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物进行分离，并对提取化合物进行杀菌活性测定。有研究结果是从紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物中分离得到7个化合物分别为5-羟基 -7,4-二甲氧基异黄酮、2- 羟基-4，4-二甲氧基查耳酮、4一二甲氧基异黄酮、鱼藤酮、2一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素。其中鱼藤酮、11一羟基灰叶素、异灰毛豆酚、异灰叶素对黄瓜霜霉活性较好。 发现紫穗槐内大多数黄酮类化合物为抗菌性化合物。超声波辅助乙醇溶液浸提法和索氏提取法提取新疆地方植物药材紫穗槐中黄酮化合物并进行含量测定。以芦丁为对照品，NaNO 2-Al(NO3)3-Na0H体系为显色剂，利用分光光度法在510nm处测定提取物中的总
22、黄酮的含量。校准曲线为 A=11825C-0.0139。r=0.9992。超声提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为23562，索氏提取法所得总黄酮的含量以芦丁计算为26375平均回收率分别为10216和9653。索氏提取法的提取优于超声波辅助乙醇浸提法，该法简单、准确，可用于新疆紫穗槐果实总黄酮的测定。西南科技大学本科生毕业论文 6在研究紫罗兰花辩类黄酮化合物的最佳提取工艺时。有方法是采用颜色反应法和紫外一可见光谱法分析紫罗兰白色品种“艾达”(Aida)、红色品种“弗朗西丝克”(Francesco)的花瓣色素，并采用单因素试验和正交试验确定2种颜色紫罗兰花瓣类黄酮化合物的最佳提取工艺。 在对紫穗
23、槐进行提取工艺的优化时，就和紫罗兰花瓣的提取有不同之处。先硅胶层析，在通过高速逆流色谱法对层析后的粗组分进行色谱法分离。1.2 天然活性产物的分析方法目前国际过内对于从植物等中提取分离的天然活性产物分析方法主要有液质联用法、硅胶层析法、和液相色谱法等，其中液相色谱法又包括固液吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法、离子色谱法等。1.2.1 液质联用法液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱- 质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势
24、的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与 MS 具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。液相色谱质谱联用仪是以液相色谱为进样分离系统并通过一定的接口与质谱仪耦合到仪器的分析仪器。样品经过色谱分离后经离子源离子化产生带有一定电荷、质量数的离子，采用不同的质量分析器把电离子按质荷比（m/z）分开,得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，进行定性、定量分析。液相色谱质谱联用仪主要由液相色谱、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和计算机等几部分组成。色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，
25、但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物，对无紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。 据统计，已知化合物中约 80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物的分析不适宜用气相色谱分析，只能依靠液相色西南科技大学本科生毕业论文 7谱。如果能成功地将液相与质谱联接使用，这一技术将在生物、医药、化工和环境等领域大有应用前景。为达到这一目的需要一个起“接口” 作用的
26、装置将液相与质谱联接起来。这个接口要解决三个主要的问题：（1）液相色谱中使用的流速较大，而质谱需要一个高真空环境工作；（2）要从流动相中提供足够的离子供质谱分析；（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染。近年来，液相色谱-质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越来越广泛，且随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技术必将在未来几年不断发展且发挥越来越重要的作用。HPLC-MS 除了可以分析气相色谱- 质谱（GC-MS ）所不能分析的强 极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点： 分析范围广，MS 几乎可
27、以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过 MS 的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；检测限低，MS 具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；分析时间快，HPLC-MS 使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；自动化程度高，HPLC-MS 具有高度的自动化。1.2.2 硅胶层析法硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸
28、附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯， 硅胶柱层析惯用方法为：（1）称量。200-300 目硅胶，称 30-70 倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g 硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。西南科技大学本科生毕业论文 8（2）搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿 /醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，
29、尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去 1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。（3）装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约 1/3 体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。（4）压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至 9/10 体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。（5）上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的
30、。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。（6）过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡，太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。例如：10mg 试样量，1g 硅胶 H，0.5ml 馏分；12g 试样量，50g 硅胶（200-300），20-50ml 馏分。(7）检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底 1-2 个数量级。（8）送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱 1.5ppm 左右所谓的“硅胶”峰。1.2.3 液相色谱法液相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。 当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析，此缺点可高效液相色谱法来克服。液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填
