1、本科生毕业论文（设计）题 目 放线菌 SZ-01 的分离鉴定及其活性物质的性质研究姓 名 学号 2011413320 院 系 生命科学学院 专 业 生物技术专业 指导教师 职称 副教授 2015 年 5 月 18 日曲阜师范大学教务处制摘要 .1关键词 .1Abstract .1Key word.2引言 .21 材料与方法 .21.1 菌株筛选 .21.2 敏感菌株 .31.3 培养基 .31.4 放线菌对不同敏感菌的抑制作用的研究.31.4.1 制备菌悬液 .31.4.1 测定抑菌圈 .31.5 菌株鉴定 .41.5.1 培养特征和形态特征观察 .41.5.3 生理生化特性分析 .41.5.
2、3 分子生物学鉴定及细胞壁类型分析 .61.6 产活性物质的性质鉴定 .61.6.1 发酵液的预处理 .61.6.2 处理后发酵液稳定性 .761.6.3 抑菌物质萃取 .71.6.4 发酵液再处理 .72 结果与分析 .72.1 菌株筛选及抗菌活性测定 .72.2 菌株鉴定 .72.2.1 放线菌 SZ-01 在不同培养基上生长情况见表 3。 .82.2.2 生理生化特性分析：放线菌 SZ-01 各种生理生化特征见表 4 .82.2.3 分 子生物学鉴定及细胞壁成分分析 .82.3 处理后发酵液的稳定性 .92.3.1 热稳定性 .92.3.2 紫外稳定性 .102.3.3 酸碱稳定性 .1
3、12.4 有机溶剂对活性物质的萃取 .113 结果与讨论 .12致谢 .12参考文献 .12放线菌 SZ-01的分离鉴定及产活性物质的性质研究生物技术专业 指导老师 摘要：本文主要是对微山湖样品采集地湖底淤泥中的放线菌的其中的一株 SZ-01 进行分离鉴定及产的活性物质的性质的研究。通过对其形态学特征、生理生化特征、细胞壁成分及 16SrDNA 的分析，发现该菌的 16SrDNA 与产红色链霉菌淡紫链霉菌的相似性较高，达到 99% ，根据聚类分析该放线菌 SZ-01 应该为产红色链霉菌的变种。放线菌 SZ-01 的发酵液经 pH 分别 2、4、6、8、10、12的溶液处理后活性物质的抑菌活性几
4、乎不变；将发酵液置于紫外灯光下分别照射20min，40min，1h，2h，3h，4h，5h，6h 后，活性物质的抑菌活性几乎不变；将发酵液经高温处理，温度低于 80，抑菌活性几乎不变，100处理 1h，抑菌活性稍有减弱，121处理 20min，仍具有抑菌活性，总体来说，发酵液中活性物质的稳定性较好。关键词：放线菌 分离鉴定 活性物质 Study on properties of actinomycetes isolation and identification of SZ-01 and production of active substancesStudent majoring in bi
5、otechnology Tutor Abstract： This article mainly conducted a preliminary identify and study to the Actinomycetes and their antimicrobial activity that were collected from Weishan lake bottom silt. analysing its morphological characters, physiological and biochemical characteristics, the cell wall com
6、position and 16 SrDNA analysis.The results showed that the bacterium Streptomyces erythrochromogenes is similar to Streptomyces lavendulae (Dan zi chain mould) with 99% similarities in 16 SrDNA , and has similarities of 98% and 98% respectively with Streptomyces flavotricini ,Streptomyces globosus,
7、Streptomyces toxy- tricini, Streptomyces bikiniensis in the aspect. According to the clustering analysis ,SZ-01 should be Strep- tomyces erythrochromogenes (produce red chain mould) varieties. Actinomycetes broth SZ-01, respectively, by the pH of the solution after treatment 2,4,6,8,10,12 antibacter
8、ial activity of the active substance is almost unchanged;The fermentation broth were placed under ultraviolet light irradiation 20min, 40min, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, the antibacterial activity of the active substance is almost unchanged; Fermentation broth by high-temperature treatment, the temperat
9、ure is below 80 , antibacterial activity was almost unchanged, 100 treatment 1h, antibacterial activity slightly decreased, 121 treatment 20min, still has antibacterial activity, in general, the fermentation broth is better stability of the active substance.Key words:Antagonistic actinomycete Isolat
10、ion and identification Active substance放线菌是一类具有重要的实用价值和经济价值的微生物，种类繁多，是生产抗生素、维生素、酶制剂、抗寄生虫和免疫调节剂等多种生物活性物质的主要生产菌，为人类的健康以及生产生活做出了巨大贡献。目前，已知的抗生素大约有 80%来自放线菌，其产生的抗生素具有抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等多种活性 1。近年来，由于化学杀菌剂的应用带来了环境与食品安全、药物残留、药害等许多问题，使环境友好的病害生防因子越来越受到重视，生防微生物的应用日益广泛，已成为农业可持续发展的重要组成部分，开发新的持续有效的拮抗菌剂或环境友好的天然抗菌物质的
11、需要日益迫切 2-4。我们从微山湖湖底的淤泥中分离筛选出来的具有广谱拮抗作用的放线菌菌株 SZ-01，对该菌株进行形态学特征、培养性状、生理生化特征几方面的鉴定，阐明其分类地位，并对其产活性物质进行了初步的而研究。为进一步找寻及开发有价值的具生物活性的微生物提供理论依据。1 材料与方法1.1菌株筛选从山东微山县境内微山湖不同的湖底环境中采集 15 个湖底淤泥样品，其中南四湖6 个样品，养殖区 3 个样品，示范区 3 个样品。采样时间为 2011 年 9 月，采样后样品立即置于无菌封口袋并保存于室温环境，样品运回学校后保存于 4冰箱中备用，采样时要注意在袋上标注具体的采样地点、采样日期和序号等，
12、方便以后记录。将采集到的 15 个淤泥样品自然风干 10后各称取 10g 于 250ml 锥形瓶中，各加入90ml 无菌水，再在每个锥形瓶中加入约 12 个小玻璃珠，于恒温振荡器中 100 r/min 振荡 10min 使泥样充分混匀，即制成 10-1 浓度的悬浊液，然后从中吸取 1ml 悬浊液依次配制成浓度为 10-2、10 -3 和 10-4 的稀释液备用。稀释液配制好后，用移液枪各吸取 10-2、10 -3 和 10-4 浓度的稀释液 200l于高氏一号培养基（内含浓度为 150 mg/L 的重铬酸钾和制霉菌素作为细菌和霉菌生长的抑制剂）上，使用涂布棒涂布均匀，然后将培养皿倒置于恒温培养
13、箱中在 28的条件下培养。7d 左右挑取单菌落在相应的培养基上进行划线后再倒置于于恒温培养箱中 28培养7d。可将此步骤多重复几遍对菌株进行高度纯化。所得纯培养物放置于 20%的甘油水溶液中-70 保存备用。采用划线分离的方法纯化，随时观察并记录菌株的原始培养结果并统一编号。根据放线菌的特征及时挑取单个放线菌菌落至高氏一号平板上，采用插片法 8在高倍镜下观察放线菌基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子的形态，最终选取一株编号为 SZ-01的放线菌对其进行研究。1.2 敏感菌株用于抑菌试验的敏感菌株有大肠杆菌（ Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aur
14、eus）、黑曲霉（ Aspergillus niger）、桔青霉( Penicillium citrinum)、高大毛霉（ Mucor mucedo）和黄曲霉（ Aspergillus flavus） ，短梗霉，均为本实验室保藏菌种。由于菌种长期在低温中保存，所以用之前要先进行菌种活化，并做好保种。1.3培养基 高氏一号琼脂培养基：可溶性淀粉 20g，KNO 3 1g，NaCl 0.5g，K 2HPO4 0.5g，MgSO 47H2O 0.5g，FeSO 47H2O 0.01g，琼脂 1520g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。LB 培养基：蛋白胨 10g，酵母粉 5g， NaCl 1
15、0g，pH 7.27.4，蒸馏水 1000ml种子培养基：200g 土豆津汁 1000ml，葡萄糖 20g，pH 自然发酵培养基：葡萄糖 10g，豆饼粉 10g，氯化钠 2.5g，碳酸钙 2g，蛋白胨 3g，pH7.2-7.4，总体积 1000ml。克氏合成 1 号培养基：磷酸氢二钾 1g，碳酸镁 0.3g 氯化钠 0.2g,硝酸钾 1g，硫酸亚铁 0.01g,碳酸钙 0.5g,葡萄糖 20察氏培养基：磷酸氢二钾 1.0g，硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，硝酸钠 2.0g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖 25.0g，琼脂 20.0g，加入蒸馏水定容至 1000ml，调节 pH 值为 7.2-7.
16、4，高压蒸汽灭菌 30min。1.4 放线菌对不同敏感菌的抑制作用的研究1.4.1 制备菌悬液取孢子悬液（约 5.1109个/ml）200l 种到种子培养基中，28摇床培养 12h后，取 1ml 接种到发酵培养基中，28摇床培养 5 天后，100加热 10min，4000rpm离心处理 30min 取上清，将上清液经微孔滤膜过滤(f =0.45 m)。滤液-20保存备用。1.4.2 测定抑菌圈先将活化培养好的指示菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌、变形杆菌、根霉菌、青霉菌和白色念珠菌）分别接入到液体 LB 培养基中混合均匀，向平皿内倒入 10ml 高氏一号培养基制备底层培养
17、基，待凝固后迅速倒入含有指示菌的培养基并在底层培养基上铺匀，待培养基完全凝固后在皿底划“十”字并做好标记，在每个上层培养基上均匀放置已经灭菌的 4 个牛津杯（内直径为 0.6cm，外直径为0.8cm，高度为 1.0cm，材质为不锈钢），分别向每个牛津杯中加入 0.2ml 的发酵液，并且设置无菌水对照，将平皿放入 37恒温培养箱中进行培养，并且在培养的第 2d 观察各组放线菌对细菌指示菌的抑制作用并测量记录抑菌圈，在培养的第 4d 观察对霉菌指示菌和真菌指示菌的抑制作用并测量记录抑菌圈。重复试验 3 次，使用十字交叉法测量出每种放线菌对指示菌的抑菌圈并求得其对每株指示菌抑菌圈的平均值进行比较。1
18、.5 菌株鉴定1.5.1 培养特征和形态特征观察将放线菌 SZ-01 分别接种在马铃薯块培养基、高氏合成 1 号琼脂培养基、察氏琼脂培养基、克氏合成 1 号培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、淀粉琼脂培养基平板上 28 培养 2130 天观察并记录培养特征；采用插片法 6观察菌株形态特征，包括菌落形态、 基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态，以及是否产生可溶性色素等。1.5.2 生理生化特性分析 1.5.2.1 放线菌水解淀粉的能力实验将放线菌 SZ-01 分别点种在淀粉培养基上，然后倒置于 28恒温培养箱中培养7d，向培养基上滴加 3-5 滴 Lugol 碘液，观察是否出现透明圈，若发现透明圈则说
19、明淀粉已被该菌体产生的淀粉酶分解，透明圈越大则表明该菌体分泌的淀粉酶的活性越高。重复试验 3 次。1.5.2.2 放线菌产生色素的能力实验制作孢子菌悬液各取 100l 于产色素培养基上涂布均匀，倒置于 28恒温培养箱中培养，在第 2d、第 3d、第 5d 和第 7d 分别观察培养基是否变成黑色，若是有黑色产生则表明该菌株能够产生色素。重复试验 3 次。1.5.2.3 放线菌液化明胶的能力实验使用穿刺法将放线菌 SZ-01 接种于明胶液化培养基中，置于 28恒温培养箱中培养，然后在培养的第 3d、第 5d、第 7d、第 9d、第 11d 和第 13d 依次观察明胶液化的情况，明胶呈现液体状态越多
20、则显示该菌液化明胶的能力越强。每次观察之前需要将培养基放入 4的冰箱中冷却 20min，重复试验 3 次。1.5.2.3 放线菌产生硫化氢的能力实验同样使用穿刺法将放线菌 SZ-01 接种于产硫化氢培养基中，置于 28恒温培养箱中培养 7d，取出试管观察培养基中是否有黑色反应，若变成黑色则说明该菌能够产生硫化氢。重复试验 3 次。1.5.2.4 放线菌使牛奶凝固与液化的能力实验将放线菌 SZ-01 分别接种于装有牛奶培养基的试管中，放于 28恒温培养箱中进行培养，在培养的第 5 天、第 10 天和第 15 天分别对培养基进行观察，若牛奶中出现了固体，就称之为凝固现象，同时在培养基中若能看到透明
21、的液体即为胨化现象，则该菌具有使牛奶凝固与液化的能力。1.5.2.5 放线菌使纤维素分解的能力实验将放线菌 SZ-01 接种于水解纤维素培养基中，准备一条长为 12 厘米的已经灭菌的滤纸条，将滤纸条的一端浸入到培养基里，另一端绕过试管口固定于外侧，在 28的条件下进行培养，在培养 26d 之后取出试管观察，若浸入培养基中的滤纸一端凝结成块状或者出现残缺易损伤则表明该菌能够产生纤维素酶使纤维素分解。1.5.2.6 放线菌对不同碳源利用的能力实验将放线菌 SZ-01 分别接入到添加了不同碳源（果糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、半乳糖、甘露糖、木糖、棉子糖、蔗糖和淀粉）的基础培养基上，并且使用没有加过碳源
22、的基础培养基作为对照组，培养于 28的条件下，培养的第 26d 取出试管观察，若培养基上长出菌落则说明这种菌株对相应培养基中的碳源利用良好，若没有生长出菌落则表明该菌不能利用相应培养基中的碳源。1.5.3 分子生物学鉴定及细胞壁类型分析基因组 DNA 的提取：菌丝体的制备和 DNA 的提取方法参照参考文献 9。以提取的DNA 为模板，以 16SrDNA 的通用引物 10：上游：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 下游：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 DNA 1l，dNTP 2l，10Buffer 2.5l，MgCl 2 2l，
23、Taq 酶 0.25l，引物 1 2.5l，引物 2 2.5l，ddH 2O L12.25lPCR 参数设定：94 预变性 5 min；94 扩增变性 1 min，52.5退火 1 min，72 延伸 2 min，30 次循环;最后 72延伸 5 min，4 保存PCR 产物利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后将扩增 PCR 产物经回收后与 pMD18-T连接后转化到大肠杆菌中，将大肠杆菌菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果与 GenBank 数据库中相关放线菌菌株的 16 SrDNA 序列进行比对，确定未知种与同属的种之间的亲缘关系，并构建物种进化树。1.6产活性物质的
24、性质鉴定1.6.1 发酵液预处理：取孢子悬液（约 5.1109个/ml）200l 种到种子培养基中，28摇床培养 12h后，取 1ml 接种到发酵培养基中，28摇床培养 5 天后，100加热 10min，4000rpm离心处理 30min 取上清，将上清液经微孔滤膜过滤(f =0.45 m)。滤液-20保存备用。1.6.2 处理后发酵液稳定性 【i0】1.6.2.1 热稳定性：分别取 3ml 新鲜发酵液加入到 9 支无菌试管中，进行如下处理：40、60、80、100 水浴处理 30min 和 1h，121 高压灭菌锅中处理 20min ,冰水中迅速冷却。以新鲜发酵液作对照，以大肠杆菌为指示菌，
25、采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。1.6.2.2 紫外光照稳定性：分别取 4ml 新鲜发酵液加入到 8 个小培养皿中。进行如下处理：距离紫外灯(20W) 30cm 处，分别照射 20min、 40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h。以新鲜发酵液作对照，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。1.6.2.3 酸碱稳定性：分别取 6ml 新鲜发酵液加入到 6 个小培养皿中，用 1 mol/L HCl 和 1mol/L NaOH 分别将 pH 调至 2、4、6、8、10、12，放置 1 h 后再将各发酵液的 pH 值调回到原始发酵液的 pH 值 7，并以新鲜发酵液作对照
26、，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法测定处理后发酵液抑菌圈大小。1.6.3 抑菌物质萃取：预处理后发酵液用等体积的三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、苯进行萃取，在磁力搅拌器上搅拌 4h 后于分液漏斗中静置过夜，分别取上、下层，以大肠杆菌为指示菌，采用管碟法以各有机溶剂为对照测定抑菌圈大小。1.6.4 发酵液再处理：预处理的发酵液经旋转蒸发至原发酵液体积的 1/5，再用 4 倍体积的乙醇洗涤沉淀10min，4000rpm 离心处理 30min 取上清，旋转蒸发至干，取发酵液原体积的 1/5 的甲醇溶解蒸干物，4000rpm 离心处理 10min 取上清，-20保存备用。2 结果与分析2.1 菌株筛
27、选及抗菌活性测定从微山湖湖底的淤泥中总共分离纯化得到 2 株菌落形态各异的放线菌，并对这 21株放线菌进行抗菌活性筛选，最后获得放线菌 SZ-01 能够抑制毛霉，青霉，短梗霉等真菌，特别是对短梗霉的抑制效果最好，对细菌的抑制作用不大。记录得到每株放线菌对指示菌所产生抑制作用的平均抑菌圈直径大小结果如表 1 所示：表 1 放线菌 SZ-01菌对各种指示菌的抑菌圈直径平均值（mm）菌 种 放 线 菌 SZ-01大 肠 杆 菌 23.6金 黄 色 葡 萄 球 菌 20.5青 霉 21.3曲 霉 15.7毛 霉 21.7短 梗 霉 25.82.2 菌株鉴定2.2.1 放线菌 SZ-01 在不同培养基上
28、生长情况见表 3。表 2 放 线 菌 SZ-01 的 培 养 特 征培养基类型 马铃薯块 高氏合成 1 号 查氏琼脂 克氏合成 1 号 葡萄糖天门冬素淀粉琼脂菌 落 形 状 近 圆 形 圆 形 扁 平 圆 形 圆 形 扁 平 圆 形菌 落 表 面 褶 皱 干 燥 干 燥 中 间 有 突 起 干 燥 干 燥 中 间 凸 起 干 燥 干 燥 中 间凸 起菌 落 边 缘 不 整 齐 毛 发 状 整 齐 整 齐 整 齐 整 齐孢 子 堆 颜 色 灰 色 灰 色 淡 灰 灰 色 灰 白 色 灰 色基 丝 颜 色 棕 褐 色 灰 黄 色 黄 色 黄 色 灰 色 黄 色色 素 有 无 无 无 无 无 无 无
29、图一是在光学显微镜下观察到的的基内菌丝和孢子丝。图 1 放 线 菌 SZ-01的 基 内 菌 丝 和 孢 子 链2.2.2 生理生化特性分析：放线菌 SZ-01 各种生理生化特征见表 3表 3 放线菌 SZ-01生理生化实验结果2.2.3 分子生物学鉴定及细胞壁成分分析16SrDNA 的 PCR 扩增得到了一条 1500 bp 左右的条带，见图 2产 色 素明 胶液 化牛 奶 凝 固胨 化产 硫化 氢淀 粉 水 解纤 维 素上 生 长碳 源利 用放 线 菌 SZ-01产 类 黑 色素明 胶液 化凝 固胨 化不 产不 产 淀 粉酶生 长利 用 葡 萄 糖 、 果 糖 、 麦 芽糖 、 乳 糖 、 半 乳 糖 、 阿 拉伯 糖 ， 不 利 用 蔗 糖 和 棉 子糖图 2 16srDNA PCR 结果测序结果得到一条 1521bp 大小的 DNA 序列，将其提交到 GeneBank 数据库进行BLAST 比对。结果与放线菌 SZ-01 序列相似性较高的菌株均属链霉菌，选取 15 株相似性最高的菌株采用 CLUSTAIW 软件进行序列分析，采用 Neighbor-Joining 法构建系统进化树，如图 3。图 3 放线菌 SZ-01 16SrDNA系统进化树
