1、重 庆 医 科 大 学本科生毕业论文论文题目 MALDI-TOF MS 对临床分离病原菌的鉴定评估作者姓名 年级 2011 级专业 生物技术论文答辩年月 2015 年 6 月二 一 五 年 六 月指导教师姓名职位 大客户经理单位名称 XXX 诊断产品（XX）有限公司0目 录中文摘要 2英文摘要 3MALDI-TOF MS 对临床分离病原菌的鉴定评估 4前 言 41 材料与方法 51.1 主要方法 51.2 主要试剂和培养基51.3 主要仪器 51.4 病原菌培养51.5 样品处理 62 结果处理63 讨论104 结论11参考文献12开题报告14致 谢151MALDI-TOF MS 对临床分离病
2、原菌的鉴定评估摘 要目的：评估 MALDI-TOF MS 对临床分离病原菌的鉴定可靠度。方法：收集了广东省某三甲医院各临床科室的标本进行病原菌培养，对培养出的可疑病原菌同时用 VITEKMS 和 VITEK 2 Compact 两种系统进行鉴定，对两种方法有不同结果的病原菌进行 16S rRNA 测序，测序的结果为金标准，比较 VITEK MS 对病原菌的准确鉴定率相对于常规方法有何变化。目前 VITEK 2 系统覆盖了全国约 60%的医院，已经成为微生物实验室的常规自动化检测系统。结果：用 MALDI-TOF MS 和常规 VITEK 2 Compact 的方法有948(92.58%)株病原
3、菌鉴定结果完全一致，VITEK MS 将 967(94.43%)株细菌鉴定到种的水平，与常规的 VITEK 2 Compact 系统的鉴定率（93.75%）无明显差异。结论：MALDI-TOF MS 是一种快速、简单、准确、低成本的鉴定方法，有望在未来取代常规的微生物鉴定。关键词：MALDI-TOF MS；病原微生物；鉴定23Evaluation of mass spectrometric identification of pathogens routinely isolated in a clinical microbiology laboratory using MALDI-TOF MS
4、ABSTRACTObjective：to evaluate the reliability of identification with MALDI-TOFMS in clinical isolates.Method: We collected specimens in a tertiary hospital of Guangdong Province for pathogen culture and suspected pathogens were identified with VITEK and VITEK 2 Compact simultaneously. Discordant res
5、ults were resolved with 16S rDNA gene sequencing,we compared the identification accuracies by MALDI-TOF MS with conventional phenotypic identification of pathogens.Currently,VITEK 2 systerms have been covered 60% hospitals in China, have become automatic detection system in a routine microbiology la
6、boratories.Results:The identification results are identical in 948(92.58%) strains.There are 967(94.43%) strains identifying to species, no significant difference in the rate of conventional identification VITEK 2 Compact system (93.75%).Conclusion: MALDI-TOF MS is a fast, simple, accurate and cost-
7、effective identification methods, is expected to replace the conventional microbial identification in the future.Key words:MALDI-TOF MS;pathogens;identification 4MALDI-TOF MS 对临床分离病原菌的鉴定评估前言病原微生物引起的感染性疾病是危害人类健康，导致患者死亡的重要原因之一。目前常规的微生物鉴定主要还是传统的鉴定方法，依赖于常规培养，分离和生化鉴定。传统方法一般需要依赖于微生物的活性代谢过程，因此需要一个较长的培养过程 【
8、1】 。而临床微生物检测需要对感染患者的检测样本进行快速鉴定以提供给临床医生对症治疗，所以传统方法明显不能满足临床检测的需求。另外分子生物学的方法，像核糖体基因测序、实时定量 PCR、基因探针等可以快速检测病原微生物，但是这种方法操作复杂、成本高，很难在临床微生物室常规开展 【2】 。为了满足临床的需求，迫切需要建立一种简便、快速、准确、经济的病原微生物鉴定方法。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight，MALDI-TOF MS）是新发展起来的快速准确的微生物鉴定方法，已经被越来越
9、多的用在临床微生物室。微生物质谱鉴定技术是微生物蛋白组学与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术相结合的革命性突破。质谱（mass spectrometry，MS ）作为一种分析手段已出现几十年，1975 年质谱技术就已初步用于细菌的快速鉴定，但直到 1988 年基质辅助激光解吸电离、电喷雾电离等软电离技术的出现才得到进一步快速发展 【3】 。2O 世纪 8O 年代后期发展的“软电离”技术使得质谱分析技术能够用于生命科学研究领域，软电离技术能够保持大分子或分子复合物在研究分析过程中的完整性 【4】 。 MALDI-TOF MS 的发展，使得质谱技术在微生物的鉴定中有了全新快速的发展。目前市场上主
10、要有两家公司的产品，生物 XXX 的 VITEK MS、VITEK MS RUO 、VITEK MS Plus 系统（Marcy IEtoile 法国）和布鲁克道尔顿的 MALDI Biotyper 系统（Bremen ，德国），因此大多数的比较研究都是使用这两家公司的产品 【5】 。截止目前应用 MALDI-TOF MS 可以鉴定几乎所有细菌，部分真菌和病毒等微生物。MALDI 的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，常用的基质主要包括 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）、-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、3,5-二甲氧基-4- 羟基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）等。基质从激光中吸收能量传
11、递给生物分子，而电离过程是将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程 【1】 。样品离子在加速电场下获得相同动能，经高压加5速聚焦后进入飞行时间检测器，离子的质荷比（m/z）与飞行时间的平方成正比，从而对样品进行分析 【6】 。理论上讲，只要飞行管的长度足够长，飞行时间检测器可以检测分子的质量数是无上限的，所以，基质辅助激光解析电离飞行时间很适合研究蛋白质、核酸等生物大分子。MALDI-TOF MS 鉴定微生物主要原理是通过检测获得微生物的蛋白质图谱，并将所得的图谱与数据库中的微生物参考图谱比对后得出鉴定结果 【7】 。蛋白质图谱是由检测器将接受、检测和记录的质量分离器分
12、离的离子后求出 m/z 值，以m/z 为横坐标，离子的相对强度为纵坐标给出 m/z 的分析图谱，不同的物质有不同的质量谱 【8】 。目前，MALDI-TOF 质谱作为一种快速准确的检测技术，已广泛用于微生物的鉴定和分类。1 材料与方法1.1 主要标本广东省某三甲医院微生物室接收的来自不同临床科室用于细菌真菌培养鉴定的临床标本，标本类型包括血液，脑脊液，胸腹水，引流液，胆汁，尿液，痰，伤口分泌物，鼻咽拭子，粪便，阴道分泌物。1.2 主要试剂和培养基（1）哥伦比亚血琼脂培养基，沙保氏葡萄糖琼脂培养基，沙门菌志贺菌(SS)琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，含复合维生素 X 的巧克力琼脂培养基，淋病瑟氏菌
13、及肠膜奈瑟菌巧克力琼脂培养基，均购自生物 XXX 公司；营养肉汤培养基，购自 XX 抚生实业有限公司；（2）-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），甲酸（FA ），均购自生物 XXX 公司；（3）基因组小量提取试剂盒，购自美国 Axygen 公司；Taq 酶及 PCR 相关试剂，购自日本Takara 公司。（4）VITEK 2 Compact 鉴定试卡，购自生物 XXX 公司。1.3 主要仪器MOLDI-TOF MS 质谱仪，法国生物 XXX 公司；电热恒温培养箱，中国 XX 新苗医疗器械制造有限公司；VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统，法国生物 XXX 公司；6VITEK 2
14、DensiCHEK Plus 比浊仪，法国生物 XXX 公司；Nu-440-44E 生物安全柜，美国 NUAIRE 公司；PCR 仪，德国 Biometra 公司1.4 病原菌培养室温下，在生物安全柜中操作，将接收到的标本接种到相应的培养基上。然后将培养基放到 37恒温孵育箱中孵育 18-24h，其中单独将沙保氏葡萄糖琼脂培养基放到 28恒温孵育箱中孵育 24-72h。不同的细菌真菌根据培养特性确定时间，当平板上出现很好的单菌落时进行上机操作。不同类型标本接种培养基情况如下（“” 代表接种此培养基）：1.5 样品处理（1）对于细菌，棉签挑取适量可疑致病菌单菌落，于一次性悬浮管中用 0.45%的
15、无菌盐水调制成0.5-0.62 麦氏浓度的菌悬液；用同样方法将真菌菌调制成 1.8-2.2 麦氏浊度的菌悬液。选择合适的VITEK 2 Compact 鉴定卡进行上机。平板类型 哥伦比亚血琼脂培养基沙保氏葡萄糖琼脂培养基含复合维生素X 的巧克力琼脂培养基麦康凯琼脂培养基沙门菌志贺菌(SS)琼脂培养基淋病瑟氏菌及肠膜奈瑟菌巧克力琼脂培养基营养肉汤培养基报阳血瓶 脑脊液 胸腹水 胆汁 引流液 尿液 痰 伤口分泌物 鼻咽拭子 粪便 阴道分泌物 7（2）用一次性 1L 接种环挑可疑取单菌落适量菌量涂在一次性靶板上，对于细菌直接再滴加 1L CHCA，自然晾干。对于真菌先滴加 0.5L FA，自然晾干后
16、再加 1L CHCA，室温下自然晾干。将靶板放入仪器中，进行质谱检测。2 结果处理（1）对于两种方法鉴定结果不一致的菌株进行 16S rDNA 测序（2）对于 VITEK 2 Compact 鉴定率小于 90%和 MADI-TOF MS 鉴定结果为低分辨率鉴定和无鉴定结果的菌株进行 16S rDNA 测序。表 1 MALDI-TOF 和 VITEK 2 Compact 结果一致的病原菌菌名 数量鲍曼不动杆菌复合群 30杰氏棒状杆菌 1布氏柠檬酸杆菌 2弗劳地柠檬酸杆菌 6克氏柠檬酸杆菌 1大肠埃希菌 297产气肠杆菌 13铅黄肠球菌 2粪肠球菌 10屎肠球菌 24鹑鸡肠球菌 1小肠肠球菌 3产
17、酸克雷伯菌 10肺炎克雷伯菌 66微球菌属 3摩根摩根菌 7铜绿假单胞菌 126恶臭假单胞菌 18嗜麦芽窄食单胞菌 33奇异变形杆菌 75普通/彭氏变形杆菌 9雷氏普罗威登斯菌 2金黄色葡萄球菌 76表皮葡萄球菌 36人葡萄球菌人亚种 37腐生葡萄球菌 1溶血葡萄球菌 14科氏葡萄球菌科氏亚种 1头状葡萄球菌 5粘质沙雷菌 23副血链球菌 1肺炎链球菌 4缓症链球菌/口腔链球菌 3解没食子链球菌 1戈登链球菌 1唾液链球菌 1无乳链球菌 5血链球菌 1海藻希瓦菌 3副溶血弧菌 1近平滑假丝酵母 2产吲哚金黄杆菌 1啮蚀艾肯菌 1沙门菌群 2单核细胞增生李斯特菌 1流感嗜血杆菌 1洋葱伯克霍尔德菌 1
