1、 蒙药吉日很阿嘎如-8 中多糖提取及抗氧化性研究作者：乌兰格日乐 白海泉 赵玉英 张文韬【摘要】 目的从吉日很阿嘎如-8 中提取，精制多糖；并研究其抗氧化性能。 方法吉日很阿嘎如 -8 经热水抽提，Sevag 法脱蛋白，乙醇沉淀，再通过透析得白色粉末状精制多糖。并采用比色法测定其对OH 和 O-2的清除能力，并用甘露醇进行比较。羟基自由基(OH)由 Fenton 体系产生，超氧阴离子自由基(O-2) 由邻苯三酚自氧化体系产生。结果吉日很阿嘎如-8 多糖对OH 和 O-2具有一定的清除能力，其达到 50%清除率所需药物浓度 EC50 分别为 0.81，2.80 mg/ml。同样条件下甘露醇达到
2、50 %清除率所需药物浓度 EC50 分别为 2.65，2.64 mg/ml。结论吉日很阿嘎如-8 多糖能有效清除OH和 O-2 ，其清除能力较甘露醇强，并且浓度与清除率呈正相关。 【关键词】 蒙药 多糖 提取 抗氧化Abstract:ObjectiveTo study the extraction, purification and antioxidant effect of polysaccharides from Jirihen Agaru-8. MethodsJirihen Agaru-8 polysaccharide was extracted with water. The her
3、b was deproteined, ethanol precipitated, and purified with dialyses method. Its antioxidant effect was tested by the colorimeter and compared with Nectar. Hydroxyl (OH) was produced by Fenton reaction and super oxide radical (O-2) was produced by the oxidation of pyrogallol.ResultsPolysaccharides of
4、 Jirihen Agaru-8 had strong scavenging effect for OH and O-2. The amounts of scavenging 50 % (EC50) OH and O-2 was 0.81 mg/ml and 2.80 mg/ml. But the amount of scavenging 50 % (EC50) OH and O-2 was 2.65 mg/ml and 2.64 mg/ml of Nectar. ConclusionJirihen Agaru-8 polysaccharides has an action to scaven
5、ging OH 和 O-2. Its activities is strong to Nectar, and presents positive correlationship with the amounts.Key words:Mongolian medicine; Polysaccharides; Extraction; Antioxidant在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟基自由基(OH)和超氧阴离子自由基(O-2)是具有代表性的自由基，超氧阴离子自由基的产生最早，OH 的作用最强。自由基的产生与机体的许多障碍和疾病的发生如吞噬、炎症、肿瘤、衰老、辐射、机体损伤等有
6、密切关系。氧化代谢过程中自由基一旦产生，便会呈几何级数增长，加入自由基清除剂后才会减少或消失1。多糖是一类具有高活性的生命大分子物质，它在抗肿瘤、抗凝血、抗炎症、刺激免疫以及降血糖方面都有一定的作用。关于蒙药多糖的研究已有报道2，吉日很阿嘎如-8 是蒙医临床上用于治疗心烦失眠、神气不宁、心脏损伤、心区疼痛等病症。本文对其多糖的抗氧化性-清除氧自由基的性能进行了研究，为开发天然的抗氧化新药提供理论依据。1 材料1.1 仪器旋转蒸发器 RE52CS( 上海亚荣生化仪器厂) ； 721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)；PHS-3B 型酸度计( 上海雷磁仪器厂)；7007 上皿 电子天平( 上海
7、天平仪器厂 )；红外 Pekin-elmer783 红外光谱仪（Pekin-elmer 公司）； UV-240 型分光光度计（日本岛津）；透析袋（36DM ，上海进口分装）。1.2 试剂藩红花红 T（生化试剂，Sigma 公司）；氯化硝基四氮唑兰 NBT(生化试剂，Sigma 公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)；硫酸亚铁铵、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘露醇等均为国产分析纯。吉日很阿嘎如-8 由内蒙古蒙药股份有限公司生产,批号为 040204 278；实验用水为二次蒸馏水。2 方法2.1 多糖的提取及精制精确称取吉日很阿嘎如-8 (药末) 30.0 g, 放入蒸馏烧瓶中，
8、用三氯甲烷、丙酮分别抽提除去色素，加双蒸馏水机械搅拌恒温加热，温度控制在 80左右，提取 3 h，共提取 3次，合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至 50 ml，加入浓缩液体积3 倍的乙醇沉淀，静置 24 h，抽滤，用无水乙醇洗 3 次后，再用丙酮、乙醚分别洗 3 次。加蒸馏水溶解，溶液经 sevag 法除去游离蛋白质。溶液浓缩，加入 95%的乙醇，醇析，静置过夜，减压抽滤，用无水乙醇洗 3 次后，再用丙酮、乙醚分别洗 3 次得吉日很阿嘎如-8 粗多糖，置于干燥器中干燥。将粗品溶解、透析、减压浓缩、醇沉、洗涤、真空干燥得精制多糖。2.2 水溶性多糖的组分分析按文献2的方法将多糖用硫酸水解、还原、
9、乙酰化后用气相色谱进行分析。结果吉日很阿嘎如-8多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成,其摩尔比 1.000.763.612.885.00。2.3 糖含量测定苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标样。标准曲线回归方程为 A=4.580 86C-0.034 68(r=0.999 2),其中 A 代表吸光度，C 代表摩尔浓度（单位为 g/ml）。加样测平均回收率为99.5%，RSD=0.95。2.4 抗氧化实验方法2.4.1 清除羟自由基的实验方法OH 由 EDTA-Na-Fe(II)-H2O2 (Fenton) 体系产生，由于OH 可特异地使藩红花红 T 褪色，根据褪色程度用比色法
10、来衡量OH 的含量1。反应体系在 PH 为 7.4 的磷酸缓冲液溶液中进行，藩红花红 T(520 g/ml) 0.2 ml, 2 mmol 的EDTA-2Na-Fe(II) 0.7 ml，不同浓度的供试液 1.0 ml，6 %的 H2O2 0.4 ml，混合均匀后于 37水浴保温 30 min，然后于波长 520 nm 处，用分光光度计测吸光度 A 值。空白组以重蒸水代替供试液。每个浓度组平行测定 5 次，求其平均值。实验结果以清除率 E%表示，EC50 表示达到 50%清除率时体系中的药物浓度。按 E%=(A 样品-A空白)/A 样品100 % 公式进行计算。2.4.2 清除超氧阴离子自由基
11、的实验方法邻苯三酚在碱性条件下易氧化产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与 NBT 作用形成紫色化合物4，在波长为 530 nm 处测定吸光度 A 值，A 值反映 O-2的含量。加入不同浓度供试液，测定样品对吸光度 A 值的影响。取 0.1 mol/L pH 为 8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 2.5 ml 于试管中，置25 水浴中预热 20 min，加不同浓度样液 0.2 ml，0.98 mmol/L 的NBT 0.6 ml，10 mmol/L 的邻苯三酚 0.3 ml，混合均匀后在 25 水浴中反应 4 min,立即用 8 mol/L 的 0.1 ml HCl 终止反应，并在波长为
12、530 nm 处测定吸光度 A 值。空白管用重蒸水代替样品。测定结果以清除率 E%=(A 空白-A 样品)/A 空白100 % 表示。3 结果与讨论3.1 多糖的含量经苯酚-硫酸法测定吉日很阿嘎如-8 中多糖的含量为 76.0 %。3.2 多糖的组成见表 1。表 1 吉如很阿嘎如-8 多糖的单糖组成及其含量（略）3.3 抗氧化活性吉日很阿嘎如-8 多糖对OH 的清除作用（见表 2） 吉日很阿嘎如-8 多糖对 O-2 的清除作用（见表 3）由表 2和表 3 可见，吉日很阿嘎如-8 多糖对OH 和 O-2清除能力较对照品甘露醇强。吉日很阿嘎如-8 多糖达到 50%清除率所需药物浓度EC50 分别为
13、 0.81，2.80 mg/ml，同样条件下对照品甘露醇达到 50%清除率所需药物浓度 EC50 分别为 2.65 mg/ml 和 2.64 mg/ml。表 2 吉日很阿嘎如-8 多糖对OH 的清除作用（略）表 3 吉日很阿嘎如-8多糖对 O-2的清除作用（略）4 讨论通过苯酚-硫酸法测定吉日很阿嘎如-8 中多糖的含量和 GC 法测定的多糖含量误差较小。这进一步说明了苯酚-硫酸法对于测定蒙药中多糖的含量也是一种简便易行的方法。实验中所用的苯酚应现用现配，且绘制标准曲线及测定糖含量时所用溶液应一致。吉日很阿嘎如-8 多糖对OH 和O2-清除能力较对照品甘露醇强。清除能力较强的原因主要是分子中存在 -糖苷键1。本实验采用的自由基模型体系所产生的OH 和O2-自由基浓度远大于体内该两种自由基浓度5，体外实验表明吉日很阿嘎如-8 多糖是良好的氧自由基清除剂。此结果有待于体内实验进一步证实。【
