1、 葎草多糖的超声提取及抑菌活性研究【摘要】 目的优化葎草多糖的超声辅助提取工艺，并研究其抑菌活性。方法以多糖中的葡萄糖含量为指标，对超声波功率、料液比和超声时间进行 L9（34）正交实验，确定超声辅助提取葎草粗多糖的最佳工艺。用 DE-52 交换柱对葎草粗多糖进行分离，以滤纸片法研究葎草粗多糖和多糖分离组分的抑菌能力。结果以水为提取溶剂，料液比 128（g/ml），超声功率 120W，超声 90 min 提取 2 次，葎草多糖的得率为 0.755。葎草粗多糖的抑菌效果具有一定的剂量依赖性；各多糖组分中 HSP-、HSP-、HSP-发挥主要抑菌作用，其中 HSP-效果最显著，HSP-抑菌效果不明
2、显，且各组分间表现出协同关系。结论超声波辅助提取葎草多糖方法可行，得率高。葎草多糖具有抑菌活性。 【关键词】 葎草 多糖 分离 抑菌活性Abstract：ObjectiveTo optimize the ultrasound-assisted extraction method and to study the antibacterial activity of polysaccharides from Humulus scandens. MethodsTaking the content of glucose as observation index, we optimized the ex
3、traction process by L9（34 ）orthogonal experiment. The Humulus scandens polysaccharides (HSP) was purified into HSP-, HSP-, HSP- and HSP- by ion exchange chromatography with DE-52. The antibacterial activity of each component was tested by means of filter paper.ResultsThe optimal extraction condition
4、s were obtained as follows: water refluxing, a ratio of solid -liquid as 1g:28ml,120W for the intension of ultrasonic power, extracting time 90min and extracting two times. Under aforesaid optimization conditions, the yield of polysaccharides was 0.755%. Antibacterial experiments indicated that the
5、inhibitory effect of crude polysaccharides showed dose-dependent. Among the isolated components, HSP-, HSP-, HSP- played main antibacterial roles and HSP- was ineffective. It was cooperative with different isolated components. ConclusionThe yield of Humulus Scandens polysaccharides is high with ultr
6、asound-assisted extraction method. The Humulus scandens polysaccharides has obvious antibacterial action.Key words：Humulus scandens; Polysaccharides; Isolation; Antibacterial activity葎草 Humulus scandens (Lour.)Merr.又名拉拉藤，拉拉秧，一年生或多年生草本植物，全国各地几乎均有分布。葎草生长旺盛，富含营养，既可以作为饲料，提高饲喂动物的生长状况，又可以药用，有清热解毒、利尿消肿之功效1
7、。据文献报道，葎草中含有木犀草素、葡萄糖苷、胆碱、挥发油、鞣质、树脂、天门冬酰胺等物质2，其提取物具有抗结核菌的功效3，因而渐渐引起人们的研究兴趣。近年对于葎草中的木犀草素、黄酮类物质的提取已有少量研究4，5，但对葎草中多糖类物质的提取和活性研究还未见报道。本文采用超声波辅助提取方法制备葎草总多糖，并对多糖的抑菌活性进行研究，以期为这一优势植物资源的开发利用提供一定的理论依据。1 材料与仪器1.1 材料葎草，采自江苏科技大学校园内，晾干后粉碎过 100目筛，干粉于干燥器中密封保存。大肠杆菌 Escherichia coli、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、苏云金芽孢
8、杆菌 Bacillus thuringiensis、链球菌 Streptococcus，由本校生物与环境工程学院微生物实验室提供。牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 3.5 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 20.0 g，水 1 000 ml，pH 7.07.2，121灭菌30 min）。1.2 试剂葡萄糖、硫酸、苯酚、活性炭、乙醇、牛肉膏、蛋白胨等，均为国产分析纯。1.3 仪器 UV-9100 紫外分光光度计， KQ5200DB 型数控超声波清洗器，FA2104 型电子精密天平，Avanti J-25 高效大容量冷冻离心机（Beckman），DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥
9、箱，瑞士Buchi 旋转蒸发浓缩仪， HWS-20 恒温水浴箱，超净工作台等。2 方法2.1 多糖的提取与纯化2.1.1 超声波提取工艺以水为提取溶剂，选择超声波提取功率、提取时间和料液比 3 个因素，各取 3 个水平，以多糖含量为实验指标，进行 L9（34）正交实验。2.1.2 粗多糖的制备准确称取葎草干粉 500.0 g，按最优工艺提取，得多糖粗提液。粗提液减压浓缩至 200300 ml 后离心，上清液加入 95乙醇醇沉；沉淀物蒸馏水复溶，10%三氯乙酸除蛋白；上清液活性炭脱色，透析袋透析后再次醇沉，沉淀依次用乙醇、丙酮洗涤，挥去残余水分，真空干燥，即得葎草粗多糖（HSP）干品。2.1.3
10、 粗多糖的分离纯化 将 70.0 g 二乙胺基乙基纤维素（DE-52）依次用 500 ml 双蒸水、500 ml 0.5mol/L 的氢氧化钠、盐酸、氢氧化钠处理，0.5 h/次，不时搅拌，并用双蒸水处理至中性，装柱柱规格：2.5 cm30 cm。精密称取 HSP100.0 mg 上样，在室温下依次用 0，0.2，0.4，0.8，1.0mol L NaC1 溶液梯度洗脱，洗脱速度 5.0 ml/min，每管收集 5.0 ml。苯酚-硫酸法6跟踪检测，收集洗脱高峰部分，透析后减压浓缩，即得精制的葎草多糖组分。2.2 多糖含量的分析方法2.2.1 多糖含量的测定采用硫酸-苯酚法6。精密称取105干
11、燥至恒重的葡萄糖 20.0 mg，置于 100 ml 容量瓶中，蒸馏水定容为标准溶液。分别量取一定体积的标准溶液，配成浓度为0，10，20，30，40，50，60 g/ml 的葡萄糖稀释液。精密吸取上述稀释液各 1.0 ml，置于 10 ml 容量瓶中，加入 5的苯酚溶液 1.0 ml，摇匀后再加入浓硫酸 5.0 ml，充分混匀后放置 30 min，冷却到室温后，在波长 490 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线（回归方程为Y = 0.011 1X-0.014 1， r=0.999 1）。2.2.2 换算因子测定精密称取 80干燥至恒重的纯化葎草多糖 HSP-II 10.0mg，加蒸馏水定容至
12、50ml，配成葎草多糖储备液。苯酚硫酸法测定吸光度，测得其葡萄糖含量。 换算因子= W/CD。式中：W 为所取的纯化多糖重量（mg），C 为多糖储备液中葡萄糖质量（mg），D 为多糖的稀释因素。实验测定结果换算因子为4.47。2.2.3 多糖含量计算多糖含量(%)=（CDF/W）100%。式中：C 为供试液中葡萄糖含量（mg），D 为多糖溶液的稀释倍数，F 为换算因子，W 为供试葎草干粉的重量（mg）。2.3 葎草多糖的抑菌活性7，8将供试菌种分别接种到装有培养基的试管内，进行扩大培养（37培养 24 h）。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制成 106 个ml 的菌悬液，备用。抑菌作用的测
13、定采用滤纸片法。将滤纸用打孔器打成直径为 6 mm 的圆形小纸片，分装于洁净干燥的小培养皿中，干热灭菌(160，2 h)后备用。将葎草多糖配置成不同浓度溶液，用无菌镊子将滤纸片放入溶液中，另取滤纸片放入蒸馏水中作阴性对照，放入 10mg/红霉素中作阳性对照，均浸泡 24 h。取制备好的菌悬液 0.2 ml，滴入已经倒有固体培养基的平皿表面，用涂布器使其均匀分布。用无菌镊子夹取浸有上述样品的滤纸片，放入含菌平皿中，每皿 3 片。按上述相应条件培养，每种菌作 3 个重复试验，量取抑菌圈直径，取平均值。3 结果3.1 超声波功率对葎草多糖含量的影响在其他条件一致的情况下（水为提取溶剂，料液比 130
14、，提取时间 90 min），取不同的超声波功率 80，100，120，140，160，180 W 和 200W 提取多糖，提取两次，合并滤液，计算多糖含量。实验结果如图 1 所示。由图1 可知，随着超声波功率的增加，葎草多糖的含量呈现出一定的波动，分别在 100W 和 160W 处出现两个峰值，且 100W 的含量高于160W。超声功率增加，对细胞壁的机械剪切作用增强，使细胞内多糖溶出率增加，溶液中多糖含量也相应提高。但随着功率的进一步增加，在促进多糖溶出的同时，对多糖的破坏作用也在加强，进而导致多糖含量逐渐下降。考虑到多糖含量和能耗多少，多糖的提取功率以 100W 较为适宜。3.2 提取时间
15、对葎草多糖含量的影响固定料液比 130，按照不同的处理时间，采用超声波功率 100W 分别提取两次，合并滤液，计算多糖含量，实验结果如图 2 所示。由图可知，多糖从细胞的溶出量与超声波作用的时间长短有关，随着浸提时间延长，由超声波引起的剪切作用和空化作用导致多糖溶出量持续上升，在处理时间为 120min 时多糖含量达到最高，比处理 60min 实验组的多糖含量多出 66.9。但时间过长，游离于溶液中的多糖分子又受到超声波的持续作用导致分子断裂，引起多糖含量下降，浸提 150min 后，多糖含量只有最高值的 71.4。由此可以得出超声波提取时间应以120min 为宜。3.3 料液比对葎草多糖含量
16、的影响按照不同料液比（ g/ml），以超声波功率 100 W 提取 120 min，合并两次滤液，测定并计算多糖含量，结果如图 3 所示。溶剂用量对提取液中的多糖含量有较明显的影响。随着提取溶剂用量的逐渐上升，物料与溶剂的接触面扩大，多糖自细胞溶出后能更加充分的扩散到溶液中，多糖含量逐渐上升，当料液比 125 时达到最大值。此后随着提取溶剂的继续增加，物料过于分散，超声波的作用相对减弱，使多糖溶出量较少，多糖含量下降。同时，液料比过大会导致溶剂浪费，多糖分离困难，后续操作成本增加，根据图 3 结果，料液比选择 125 为宜。3.4 正交实验在单因素实验的基础上，以超声波功率、浸提时间和料液比作
17、为主要因素进行正交试验设计，葎草干粉用量为每份 1.0g，对提取液中的多糖含量进行测定计算，结果见表 1。由表1 可知，在所试的 3 个因素中，料液比对提取液中多糖含量影响最大，时间次之，功率影响最小。其理论最优提取工艺为 A3B1C3，即功率 120 W，时间 90 min，料液比 128，其组合条件不在本次正交实验组中，按照 A3B1C3 进行补充实验，其提取液中的多糖含量为 0.755%，高于正交实验中的最高值。因此，采用超声波进行辅助提取时，按 128 料液比，120 W 超声波功率，浸提 90 min 时，多糖含量达到最高值。表 1 正交实验结果分析（略）3.5 葎草粗多糖的分离采用
18、 DE-52 进行粗多糖的初步分离。根据跟踪测量结果，以试管编号为横坐标，多糖的量为纵坐标做洗脱色谱图（图 4）。根谱图准确收集了 HSP-、HSP-、HSP-和 HSP-4 种组分。各种组分经浓缩醇沉干燥，得质量分别为：10.4，39.83，23.58 和 8.6mg。用双蒸水洗脱的色谱峰 HSP-为中性多糖，不同离子强度的氯化钠溶液的洗脱峰为酸性多糖。3.6 葎草多糖对细菌的作用效果将制备的葎草粗多糖配成1.0，10.0，100.0 mg/ml 3 个浓度的水溶液，采用滤纸片法进行葎草粗多糖的抑菌实验，结果见表 2。由表 2 可知，葎草粗多糖对 4 种菌均有不同程度的抑制作用，且随着葎草粗
19、多糖浓度的加大，抑菌作用也逐渐增强。相同浓度下，多糖溶液对大肠杆菌的抑菌效果最好，明显大于对其他菌种的抑制作用，这可能与大肠杆菌为革兰氏阴性菌，其他菌种为阳性菌有关。将 HSP-、HSP-、HSP-、HSP-均配成 10.0mg/ml 的溶液，进行抑菌实验，结果如表 3 所示。由表 3 可知，葎草多糖各组分的抑菌效果存在较大的差异性。HSP-和 HSP-对大肠杆菌具有很强的抑制作用，但对苏云金芽孢杆菌的抑制作用很弱，对后者的抑菌圈直径仅为对前者抑菌圈直径的 17%。和 26%HSP-和 HSP-对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，明显高于 HSP-和 HSP-的抑制效果。此外对链球菌起到抑制作用主
20、要是 HSP-，其他组分作用则很弱。而对苏云金芽孢杆菌的抑菌效果，4 种多糖组分都很微弱，几乎没有，但是葎草粗多糖对其抑菌效果却较好，可能是通过 4 种组分中的两种或几种协同作用实现的。总体看来，HSP-的抑菌作用最为明显，HSP-的抑菌效果最小，但从分离所得含量上来看，后者明显高于前者，因此葎草的抑菌活性更多的应是不同组分之间的协同作用。表 2 葎草粗多糖作用于不同菌种的抑菌圈直径cm（略）表 3 葎草多糖组分作用于不同菌种的抑菌圈直径 cm（略）4 结论葎草叶片超声辅助水提取的工艺简单，成本较低，得率较高，最佳提取工艺为：料液比 128（gml），超声波功率 120W，提取时间 90min，提取两次，多糖得率可达 0.755%。葎草粗多糖经 DE-52 柱层析分离后可得四种组分：HSP-、HSP-、HSP-和 HSP-，其中 HSP-含量最大。葎草叶片多糖对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌均有一定程度的抑制作用，因而在食品防腐和医药领域的开发前景广阔。【
