1、 慢病毒载体导入整合素 1 基因对疑难癫痫细胞神经网络合成和分子结构研究前 言 目前，癫痫的发病机制仍不完全清楚，受到研究者们普遍关注的是离子通道学说和神经网络学说。神经网络学说认为，反复发作的易感性的存在是癫痫最为突出的病理生理特征。借助倒置荧光显微镜和双光子激发荧光成像技术观察电刺激下的转基因鼠的杏仁核，其神经突触末端可以与下位或者邻位神经元形成新的突触联系，随着癫痫的反复发作，这些初期可逆性突触异常连接逐渐成为固定的新连接，病理学研究发现其主要成分为苔藓纤维的芽生（Mossy fiber sprout，MFS ），即与神经元树突形成新的轴突联系，引起异常兴奋性环路重建3。已有研究表明，癫
2、痫的反复放电造成神经突起异常生长，生长锥结构改变，轴突改向，突触重构，最终形成异常的神经网络，其中的生长锥的异常生长和突触重构在难治性癫痫的难治性形成中起着关键的作用4,5。因此，从整合素分子水平来研究突触重构和异常神经网络形成在癫痫发病机制中的作用将具有重要意义。本实验在前期研究的基础上，将按照 Sombati16-19等方法制备癫痫细胞模型，采用 Real-time qPCR 方法检测体外 Sombati 癫痫细胞模型中的重要的神经元细胞表面受体整合素 1（Integrin 1），探讨内源性 Integrin 1 对海马神经细胞生长的影响，探讨其在癫痫致痫性形成过程中的作用及其分子调节机制
3、；通过构建慢病毒载体沉默内源性 Integrin 1，采用 Real-time qPCR 、e qPCR 检测大鼠 Sombati 癫痫细胞模型中 Integrin 1 基因表达变化 1 材料和方法荧光定量 PCR 仪 7500 Fast ABI 公司荧光显微镜 Olympus 公司Olympus IX 51 倒置显微镜 Olympus 公司So 公司 电子精密天平 BS2245 北京赛多利斯仪器系统有限公司台式高速冷冻离心机 3K-15 Sigma 公司 电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂立式自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX-40SII 上海申安医疗器械厂自动三重纯水蒸馏器 SZ-97 上海
4、亚荣生化仪器械厂2 结 果整合素是按不同的组合构成 24 种整合素，含 1 亚单位的整合素主要介导细胞与细胞外基质成分之间的粘附20。研究认为，Integrin 1 作为细胞重要的跨膜糖蛋白，广泛表达于神经系统，是重要的神经元表面细胞受体，是连接细胞外基质和细胞骨架蛋白的重要分子结构，可以与层粘连蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质成分结合，参与细胞外环境信息交换，维持细胞骨架，影响神经元极性，并介导神经元的分化、迁移，参与神经突触的形成及突触后介质的成熟，在神经生长发育过程中起重要作用21-23。它们不仅参与神经系统的发育和可塑性，而且和成熟神经元的病理状态密切相关。第二部分 Integrin 1
5、 shRNA 重组慢病毒载体的构建及其对 Sombati 癫痫细胞 Integrin 1 基因表达的影响. 29材料与方法29 结果47 讨论50 第三部分 Integrin 1 沉默后 Sombati 癫痫细胞的 FAK 依赖相关信号通路蛋白表达变化 5555 材料与方法55结果.64讨论65结论69第三部分 Integrin 1 沉默后 Sombati 癫痫细胞的 FAK 依赖相关信号通路蛋白表达变化1 材料与方法在第一部分中，我们实验结果提示在 Sombati 癫痫细胞中的 Integrin 1 异常高表达可能与癫痫的形成和发展相关，然而，其细胞内信号转导途径尚未十分清楚。Integri
6、n 1 的主要生物学作用是介导细胞与细胞、细胞与外基质之间的相互粘附，其作为跨膜接头在细胞外基质与细胞内肌动蛋白骨架之间起双向的联络作用，目前研究认为，Integrin 1 主要通过激活两种酪氨酸依赖性通道发挥作用，即粘附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK ）和 SHc 通道，本部分实验拟利用构建的 Integrin 1 重组慢病毒载体，沉默 Sombati 癫痫细胞中的内源性的 Integrin 1，对 Integrin 1 在Sombati 癫痫细胞中的 FAK 相关信号途径进行初步探讨。2 结 果整合素是以 和 两个亚基结合而形成的异二聚体糖蛋白，目前已经至少发现
7、 24 种亚型53,54。整合素的 和 两种亚基都是型跨膜糖蛋白，它们在结构上具有以下的共同特征：都有一个较长的胞外域、一个单次跨膜域和一个较短的无催化作用的胞内域（4 亚基除外）。整合素 亚基分子量基本分布在 90000-110000Da 之间，根据 亚基种类的不同，可分为 8 个（1-8）不同的亚家族，其中的整合素 1 亚家族又称为迟现抗原组（VLA）,1(CD29) 在体内广泛表达，1 整合素亚单位可以与 CD49a-f（1-6）、 CD51（v）以及 7-11 分别组成 VLA-1 至 VLA-6、v1（VNR-1）、71、81、91 和111 整合素分子55,56 。含 1 亚单位的
8、整合素主要介导细胞与细胞成分之间的作用,与细胞骨架结构分子相互结合可以活化 T 细胞，并调节 CD 分子的活性,在整合素分子和配体结合过程中，最常见的识别序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD），即 RGD 序列,其可根据其识别的配体分子的不同，分为 3 大类，分别为：识别 RGD 序列的整合素分子，包括51、v1；识别非 RGD 序列的整合素分子，包括21、41；识别序列不明确的整合素分子，包括 11、61、71、81 等55。.结 论1 结合我们前期的关于整合素研究成果，推测 Integrin 1 基因可能参与了难治性癫痫的形成过程，尤其是 Sombati 癫痫细胞持续自发性放电后的后期异常神经网络的重组过程。3 通过 5-GGAGGATTACTTCAGACTTCC-3构建的慢病毒载体能在新生大鼠海马神经元和 Sombati 癫痫细胞中实现有效的基因沉默效应。Integrin 1 在 Sombati 癫痫细胞中发挥作用依赖于 FAK 相关通路的激活，主要是启动了 Tyr397 磷酸化位点，但与 Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和 Phospho-PAK1 (Ser199/204) / PAK3 蛋白的激活无关。.
