1、 苦蘵多糖的提取及体外抗氧化活性的研究【摘要】 目的研究苦蘵多糖的醇沉条件及其体外抗氧化活性。方法经超声提取，除脂，除蛋白等工艺得到苦蘵粗多糖，并考察了醇沉条件(醇沉比、温度、pH、时间、浓缩比)对多糖沉淀的影响。采用体外实验研究了苦蘵多糖对OH 和 DPPH 的清除作用及对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。结果在最佳的醇沉条件(浓缩比 41,温度-20 ，醇沉时间 16 h，醇沉比为 14，pH 为 7)下，多糖提取率为 3.15%。多糖对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制率可达 80%,对OH和 DPPH 也都有很好的清除作用。结论苦蘵果实中多糖有良好的体外抗氧化活性。 【关键词】 苦蘵 多糖 抗氧
2、化Abstract:ObjectiveTo study the antioxidant activities of polysaccharide extracted from Physalis pubescens L.MethodsPolysaccharide was extracted from Physalis pubescens L. fruit by ultrasonic method, the content was determined by spectrophotometry, the in vitro scavenging activities of polysaccharid
3、e on hydroxyl radical and DPPH,and its protective effects on lipid peroxidation of liver homogenate in rats were investigated in this study.ResultsPolysaccharide had strong scavenging effect on hydroxyl radical and DPPH,its effect on superoxide radical was week,and it showed significant protective e
4、ffect on lipid peroxidation of liver homogenate in rats.ConclusionThese results suggest that the polysaccharide extracted from Physalis pubescens L. has good antioxidant activities in vitro.Key words:Physalis pubescens L.; Polysaccharide; Antioxidation property苦蘵,别名：蘵、黄蒢(尔雅)，小苦耽(本草拾遗) ，灯笼泡草(广东医学祖国医学
5、版(2) ：8.1966) ，响铃草、响泡子(湖南药物志)，绿灯、野绿灯(上海常用中草药)。茄科酸浆属植物，拉丁名：Physalis pubescens L.以果、根或全草入药，性味苦、寒。功用主治：清热解毒，利尿消肿，消肿散结，凉血止血。现代研究报道，其化学成分为酸浆果红素，即玉蜀黍黄素二棕榈酸酯1 。但对其多糖的研究国内外未见报道，为深入开发这一丰富自然资源，本实验对其多糖进行了提取、纯化及抗氧化的研究，为苦蘵的中药现代化奠定了一定的理论基础。1 材料与方法1.1 试剂与仪器 DPPH 试剂 美国 Sigma 公司，2-硫代巴比妥酸 上海国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯；5
6、810R 型冷冻离心机 德国 Eppendorf 公司，723 型可见分光光度计 山东高密彩虹分析仪器有限公司，RE-52AA 型旋转蒸发器 上海雅荣生化设备仪器有限公司，BP221S 型电子天平 德国赛多利斯。1.2 多糖的提取及初步分离纯化称取苦蘵鲜果 1 000 g 烘干，加一定量的水 60 W 超声 6 min，8 000 r/min 离心 7 min，上清液抽滤后浓缩，用醋酸乙酯加热回流 1h 进行除脂脱色2，再用Sevage 法3去除蛋白得粗多糖。1.3 醇沉条件的研究1.3.1 浓缩比将粗多糖溶液浓缩后，分别加入 4 倍体积 95%的乙醇，4下醇沉 12 h。多糖用一定量的蒸馏水
7、溶解后测定含量。1.3.2 温度取 3 份粗糖溶液分别加入 4 倍体积的 95%乙醇，然后置于-20 ，4，室温（25）进行醇沉。溶解后分别测其多糖含量。1.3.3 醇沉比取 5 份粗糖液分别以11,12，13，14，15（糖液95%乙醇）比例加入乙醇。在 4醇沉 12 h。溶解后测多糖含量。1.3.4 醇沉时间4分别选择 4，8，12，16，18，20，24 h进行多糖含量检测，其他条件均按摸索的最佳条件设置。1.3.5 pH 分别选择 pH 为 4，5，6，7，8，9,6 个值进行多糖含量检测，其他条件均按摸索的最佳条件设置。1.4 体外抗氧化的研究1.4.1 对OH 的抑制作用5采用亚铁
8、离子催化过氧化氢产生OH（根据 Fenton 反应原理），由于 OH 可特异地使番红褪色，根据褪色程度用比色法来测量OH 的含量。4 ml 体系中包含 150 mmol/L,pH=7.4 的磷酸缓冲溶液 1.5 ml，260 g/ml 番红花红 0.2 ml，0.56 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠 (Fe2+EDTA)0.7 ml,1% H2O2 0.8 ml，各浓度糖液 0.8 ml。1.4.2 对肝脂质过氧化的抑制6过氧化脂质的二级分解产物丙二醛能与硫代巴比妥酸反应生成红色产物，在 532 nm 处有最大吸收。大鼠脱颈处死后迅速分离肝组织，用生理盐水洗净,冰浴下匀浆，制成 0.5%的肝匀
9、浆液。取匀浆液各 1 ml，加入不同质量浓度的糖液 1 ml 和 6 mmol/L,EDTA-Na-Fe（） 100 l,最后加 60 mmol/L H2O2 100 l。以生理盐水代替糖液和 H2O2 为空白，以生理盐水代替糖液为对照，整个体系为 2.2 ml。在 37下水浴 1 h 后，加入 1 ml15%TCA 终止反应，再加入 1 ml 体积分数 0.7%TBA,于沸水中显色 15 min,冷却后离心，测 532 nm 处上清液的 OD 值。1.4.3 对有机自由基 DPPH 的清除作用 7DPPH 分光测定法的测定原理是依据 DPPH 在 517 nm 处有一强吸收峰,其乙醇溶液呈深
10、紫色。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可用分光法进行定量分析。抗氧化活性以清除 DPPH 自由基能力大小表示。各取 2 ml 0.2 mmol/L 的 DPPH 溶液（以乙醇为溶剂），加入不同质量浓度的糖液。以 50%乙醇代替 DPPH 为空白，以 50%乙醇代替糖液为对照。摇匀后在室温下反应 30 min,517 nm 处测吸光度。2 结果2.1 醇沉条件对多糖提取率的影响醇沉法提取苦蘵多糖时浓缩比、温度、醇沉倍数、pH、时间对多糖提取率的影响。结果见表15。表 1 浓缩比对多糖提取影响（略）由表 1 可见，多糖浓度随
11、浓缩比的增加而增加，当浓缩比达到41 时，多糖浓度达到峰值，再增大浓缩比多糖浓度反而下降，说明 41 为最佳浓缩比。由表 2 可见，多糖浓度随温度的降低而增加，但变化幅度并不明显，考虑到工业生产，因此选择在 4进行醇沉。表 2 醇沉温度对多糖提取的影响（略）由表 3 可见，多糖浓度随醇沉倍数的增加而增加，当醇沉倍数为4 时，多糖浓度达到峰值。表 3 醇沉倍数对多糖提取的影响（略）由表 4 可见，多糖浓度随时间的延长而增加，当醇沉时间达到16 h 时，多糖浓度达到峰值。表 4 醇沉时间对多糖提取的影响（略）由表 5 可见，在酸性条件下，得到多糖浓度较低，当 pH 升高到7 时达到峰值，在碱性条件
12、下，得到的多糖浓度略有下降。综合上述试验结果，得出苦蘵果实中多糖提取的最佳条件为：浓缩比 41,醇沉温度-20，醇沉倍数 41,pH 为 7，醇沉时间为 16 h。此条件下，1 000 g 鲜果中提取多糖量为 31.5 g。表 5 醇沉 pH 对多糖提取的影响（略）2.2 体外生物活性实验2.2.1 对OH 的抑制作用羟自由基(OH)被认为是毒性最强的活性氧自由基，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病发生，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成。本实验结果表明，苦蘵中多糖体外有显著的清除羟自由基的作用（见图 1）。当多糖浓度超过 0.39 mg/ml 时，即有明显的清除羟自由基的作用，随着多糖浓
13、度的升高，其清除作用也逐渐加强，呈现量-效关系。2.2.2 对大鼠肝质脂过氧化的抑制作用由 Fe2+H2O2 系统产生的OH-可诱导质脂过氧化反应，生成丙二醛。实验表明，苦蘵中多糖在体外能明显抑制OH-诱导大鼠肝脏质脂过氧化，氧化产物丙二醛的含量随加入多糖的浓度的上升而下降，呈量效关系。但当多糖浓度大于 0.1 mg/ml，多糖对脂质过氧化的抑制率接近 80%，不再继续升高。见图 2。2.2.3 对有机自由基 DPPH 的清除作用如图 3，实验证明，苦蘵中多糖对有机自由基 DPPH 有较好的清除作用，且成量-效关系。0.98 mg/ml 的多糖可使清除率达 80%。3 讨论多糖是重要的生物高分子化合物，分布广泛，其功能也多种多样。本文研究表明，苦蘵多糖具有良好的生物活性、对脂质过氧化的抑制率及清除自由基的综合能力，而不少疾病的发生均与自由基引发的脂质过氧化反应有关，如衰老。对苦蘵多糖的结构及相关修饰研究将会更加进一步地开发其生物功能。【
