1、 苦瓜蛋白对 K562/A02 耐药逆转作用的研究作者：尹丽慧，叶爱芳，熊术道，韩义香，章圣辉，吴建波【摘要】 ：目的观察苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞多药耐药的逆转及对 Pgp 表达、功能的影响。方法采用 CCK8 法测IC50，用流式细胞仪测定苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞上 Pgp 表达及细胞内 ADM 潴留的影响。结果苦瓜蛋白能提高 K562/A02 对多种化疗药物敏感性，使 Pgp 蛋白表达下降，提高细胞内 ADM的浓度。结论苦瓜蛋白能部分逆转 K562/A02 的耐药性，逆转机制与下调 Pgp 蛋白的表达有关。 【关键词】 白血病；苦瓜蛋白；多药耐药;P糖蛋白Abstrac
2、t：Objective To explore effect of momordin on reversion of multidrug resistance (MDR) in K562/A02 cells, and expression and function of Pglycoprotein (Pgp ). Methods IC50 was detected by CCK8, and expression of Pgp and retention of ADM in K562/A02 cells were detected by flow cytometry (FCM). Results
3、Momordin can improve sensitivity of K562/A02 cells to many kinds of chemotherapeutical drugs, result in decrease of expression of Pgp, and raise concentration of ADM within cells. Conclusion Momordin can partly reverse drug resistance of K562/A02 cells, the mechanism of reversion is related with dow
4、n regulation of expression of Pgp.Key words: leukemia; momordin; multidrug resistance; Pglycoprotein白血病细胞对化疗药物产生多药耐药(MDR)是临床上白血病患者化疗失败和复发的主要原因，而多药耐药基因（MDR1）编码的细胞膜糖蛋白 P170 过度表达，导致细胞毒药物从肿瘤细胞内外渗，使肿瘤细胞内药物浓度下降是 MDR 最常见，最主要的发生机制。因此，通过采用对 Pgp 的调节，抑制其过度表达，从而使肿瘤的MDR 发生逆转或部分逆转，将对临床肿瘤患者的治疗有非常积极的意义。苦瓜蛋白是从苦瓜种子中分
5、离出来的一种碱性蛋白，属于 I型核糖体失活蛋白，研究表明，其能显著抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，具有较强的抗肿瘤作用12，但目前有关苦瓜蛋白逆转 MDR 的研究国内外少有报道，本研究观察其对 K562/A02 细胞耐药性的影响，期望为白血病 MDR 治疗寻找一种新的药物。1 材料1.1 细胞株 K562 上海中科院细胞库； K562/A02 中国医学科学院血液学研究所。苦瓜蛋白是本实验室提取3，RPMI1640 美国 GIBCO 公司；胎牛血清天津市正江高科技有限公司； 100 青霉素链霉素双抗液 美国 GIBCO 公司；阿霉素和柔红霉素 浙江海正药业股份有限公司；长春新碱 广州明兴制药有限
6、公司；柔红霉素 浙江海正药业股份有限公司；CCK8 日本同仁化学研究所；荧光标记单抗 BD 公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 人红白血病细胞株 K562 及耐药株 K562/A02 用含10%FBS，100U 青、链霉素的 RPMI1640 培养液， 37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，长满后按悬浮细胞常规传代法进行传代培养。1.2.2 细胞毒性试验取对数生长期细胞，按 1105/ml 接种 96 孔板，24h 后分组加入实验药物，每组 6 复孔，继续培养 48h，加入 CCK8，37孵育1h，酶标仪测 OD 值，计算细胞增殖抑制率，IC50，耐药倍数和逆转倍数，以抑制率不大于 1
7、0%的药物浓度作为逆转浓度，耐药倍数=耐药细胞的 IC50/敏感细胞 IC50，逆转倍数=耐药细胞 IC50/逆转后耐药细胞的 IC50。1.2.3 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞表面 Pgp 表达的影响 取对数生长期细胞，按 1105/ml 接种于 24 孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用 48h 后，每个样本收集细胞 2105 个细胞，PBS 洗一次，重悬于 100lPBS 液中，阴性对照组加入 10l 的Mouse IgG2，其余各组加 10l 的 Pgp PE，室温避光孵育20min，PBS 洗一次，加 1%多聚甲醛 250l，FACS Calibur 型流式细胞仪检测。1.2
8、.4 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞胞内药物浓度的影响：取对数生长期细胞，按 1105/ml 接种于 24 孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用 24h 后，加入 10g/ml 的 ADM 孵育1h，PBS 洗 2 次，加 1%多聚甲醛 250l，流式细胞仪检测。 1.2.5 统计学分析 检验结果以 xs 表示，样本均数比较采用 t 检验，P0.05为统计学差异有显著性。2 结果2.1 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞毒性试验 苦瓜蛋白能够抑制 K562/A02 细胞生长，抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈明显的剂量依赖关系，见图 1。48h 的 IC50为 20.9g/ml，2g/
9、ml 和 5g/ml 的苦瓜蛋白对 K562/A02 的抑制率分别为 4.2%和 9.9%，我们选择以 5g/ml 作为逆转剂量。2.2 苦瓜蛋白对 K562/A02 药敏性的影响 K562/A02 细胞对多种化疗药物耐药，耐药倍数从28.7152.2，见表 1。5g/ml 的苦瓜蛋白联合化疗药物共同作用于K562/A02 细胞，能使细胞对多种化疗药物的 IC50 下降，逆转倍数分别为 4.06.5 倍，见表 2。表 1 K562/A02 细胞的耐药程度（略）表 2 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞耐药的逆转作用（略）2.3 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞表面 Pgp 表达的影响 流式细
10、胞仪检测显示，K562 细胞不表达 Pgp 蛋白，K562/A02 细胞表面 Pgp 蛋白高表达，表达率为（94.883.37%），5g/ml 苦瓜蛋白处理后细胞表面 Pgp 表达下降明显，表达率为（80.332.30%）（n=3）（P0.01），下降了 14.55%，见图 2。2.4 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞内药物浓度的影响流式细胞仪检测 ADM 蓄积水平结果显示：K562/A02 平均荧光强度（30.692.16）与 K562 细胞的（219.168.23）相比，明显下降（P0.01），流式图上表现波峰左移，细胞平均荧光强度明显减弱，说明耐药的 K562/A02 细胞内药物平均浓
11、度降低。经 5g/ml苦瓜蛋白处理 48h 后，波峰右移，细胞平均荧光强度增强（60.472.97）（P0.01 ），说明苦瓜蛋白增加了 ADM 在耐药白血病细胞内的蓄积，细胞的耐药性部分得到纠正（图 3）。3 讨论白血病 MDR 是白血病化疗的一大障碍，克服白血病 MDR，提高抗癌药物疗效已经成为白血病治疗急待解决的关键性的课题。体外被证实具有逆转耐药活性的化合物或生物制剂有很多，如环胞霉素、异博定等，但因它们对心、肾的毒性，使其临床应用收到限制。目前，国内外学者正积极寻找高效、低毒、逆转效果显著的肿瘤耐药逆转剂。苦瓜在中国、东南亚、土耳其等地均有广泛的栽种和药用历史，本草纲目中记载，苦瓜具
12、有“除邪热，解劳乏，清心明目”等功效。有研究表明，宫颈癌患者抗癌过程服用苦瓜45d90d，其 Pgp 水平明显下降，而单纯化疗的患者无此项改变4。苦瓜蛋白是苦瓜的主要有效活性成分之一，其主要抗癌的作用机理是抑制 DNA、RNA，从而抑制蛋白合成，我们猜想其可能具有抑制 P gp 表达，逆转耐药的作用，因此，通过本实验研究对其进行探讨。 Pgp 是 ATP 结合盒转运蛋白超家族中的成员之一，由两个序列高度相似的重复部分构成，通过消耗 ATP 将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动泵除细胞外，减少细胞内药物蓄积，从而逃避抗癌药物的杀伤作用。K562/A02 细胞是以 Pgp 蛋白升高为主要耐药机制的细胞株
13、，它对多种化学结构和药理机制不同的临床常用抗癌药物有不同程度的耐药现象5。我们的实验结果也证实了K562/A02 对 ADM，VCR 和 DNR 交叉耐药，耐药倍数从 28.7152.2倍不等。无毒剂量的苦瓜蛋白能够增强 K562/A02 细胞对 VCR,ADM及 DNR 的敏感性，使其对上述药物的 IC50 明显下降，逆转倍数分别为 6.5 倍，5.4 倍和 4 倍，表明苦瓜蛋白能部分逆转 K562/A02 细胞的耐药性。流式实验结果显示：苦瓜蛋白能抑制 K562/A02 细胞表面 Pgp 的表达，表达率下降了 14.55%；进一步的 ADM 蓄积实验表明，苦瓜蛋白确实能明显增加 K562 内 ADM 的潴留，提示苦瓜蛋白逆转耐药与其抑制 Pgp 表达或抑制其功能，减少了 ADM 的外排有关。苦瓜蛋白具有 RNA N糖苷酶的活性，抑制 Pgp 表达可能与其作用于真核细胞核糖体 28S rRNA 第 4323 为腺嘌呤糖苷键水解断裂，导致 60S 亚基失活，从而使蛋白质合成受到抑制有关。苦瓜蛋白是从苦瓜中提取的有效活性成分，毒性小，本实验证实其确实具有显著逆转 K562/A02 耐药，逆转的部分机理与 Pgp 表达受抑有关。如果能进一步的在体内实验中证实苦瓜蛋白 MDR 逆转作用，并将其开发成新药，对克服白血病 MDR、战胜白血病具有重要的理论和现实意义。【
