1、 过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。2、仪器设备 研钵；离心机；250ml 容量瓶；移液管（0.5ml、2ml 各2支） ；10ml 试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1% 聚乙烯吡咯烷酮） ；0.1mol/L H2O2（用0.1mol
2、/L 高锰酸钾标定） 。【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入23ml 4下预冷的 pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 5下保存备用。2.酶活性测定取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表 2-14-1顺序加入试剂。表2-14-1 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2粗酶液(ml) 0
3、.2 0.2 0.2 蒸馏水 /ml 1.0 1.0 1.0pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5将 S0号管在沸水浴煮 1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在 25预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算： 以每分钟 A240减少0.1的酶量为 1个酶活单位（U ） 。过氧化氢酶活性 U/(g.min)= WtVAST1.024A240= AS0)(21S式中 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1
4、, AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积（ml） ；V1测定用粗酶液体积（ ml） ；FW样品鲜重（g） ；0.1A240每下降0.1 为1个酶活单位（u） ；t加过氧化氢到最后一次读数时间（ min） 。【注】 所用 H2O2溶液及 KMnO4一溶液临用前需重新标定。【注意事项】 凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。高锰酸钾滴定法一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出
5、消耗的 H2O2 的量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料小麦叶片（二）仪器设备1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。（三）试剂：1. 10%H2SO4。2. 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液。3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液 取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用 0.1mol/L 草酸溶液标定。4. 取 30%H2O2 溶液 5.68ml，稀释至 1000ml，用标准 0.1mol/L KMnO4 溶液（在酸性条件下）进行标定。5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯 H2C2O4.2H2O 12
6、.607g，用蒸馏水溶解后，定容至 1000ml。三、实验步骤（一）酶液提取取小麦叶片 2.5g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心 15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取 50ml 三角瓶 4 个（两个测定，另两个为对照） ，测定瓶加入酶液 2.5ml，对照加煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于 30恒温水浴中保温 10min，立即加入 10%H2SO42.5ml。（三） 、用 0.1mol/L KMnO4 标准溶液滴定，至出现粉红色（在 30min 内不消失）为终点。四、结果计算酶活性用每 g 鲜重样品 1min 内分解 H2O2 的 mg 数表示：过氧化氢酶活性（mg/(g.min)（AB）× tWVBAST7.1)(式中：A 对照 KMnO4 滴定 ml 数；B 酶反应后 KMnO4 滴定 ml 数；VT 提取酶液总量（ml ） ；VS 反应时所用酶液量（ml） ；W 样品鲜重（g） ；t 反应时间（min） ；1.7ml 为 0.1mol/L KMnO41ml 相当于 1.7mgH2O2。
