1、过氧化氢酶活力测定 碘量法目的意义 过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。学习几种测定CAT 活性的方法，理解其测定原理。一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。H 202 的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。其反应为：H2O2 十 2
2、KI 十 H2S04 I 2 十 K2S04 十 2H20I2+2Na2S2O32NaI+NaS 406二、材料、设备与试剂1植物材料 小麦或其他植物新鲜叶片。2主要设备 天平、研钵、 100ml 容量瓶、50ml 酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml三角瓶。3试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L 的硫酸 取 1000ml 烧杯 1 只，加入约 500ml 蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到 1000ml。(3)10的钼酸铵溶液：称取钼酸 10g，溶于蒸馏水中使成 100ml。(4)1淀粉溶液：取 1g 可溶性淀粉于小烧杯中加约 20ml 水调匀，慢慢
3、倾入约 80m1 沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量 HgCl2 防腐)。(5)0.05mol/L 硫代硫酸钠 称取 Na2S2O35H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约 0.1gNa2CO3， ，并稀释至 1 升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。一天后进行标定。标定方法：精确称取分析纯 K2Cr207 约 015g 于 500ml 三角瓶中，加 30ml 蒸馏水溶解，加入 2gKI 和 5ml 6mol/L 盐酸，在暗处放置 5min，然后用水稀释至 200ml，用 0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入 1ml 淀粉溶液，
4、继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr 3+离子的颜色)为止。计算出 Na2S203 的浓度(K 2Cr2O7 的相对分子质量为 29418)。(6)0.01mol/L 硫代硫酸钠，用 20ml 移液管吸取标定过的 0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液20m1，加入 100ml 量瓶中，加水定容，摇匀即成，用时现配。(7)0.05mol/L 过氧化氢，取 1ml 30的过氧化氢用水稀释至 150ml，用 0.05mol/L 硫代硫酸钠标定。三、操作方法1酶液提取 称取混匀的新鲜小麦叶片 1g，置研钵中加 0.2g 碳酸钙和蒸馏水 2m1，仔细研磨成匀浆，移入 100mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，
5、振荡片刻，静置。取上清液 10ml 移人 100ml 量瓶加蒸馏水稀释至刻度(稀释 10 倍)、摇匀备用。2反应 取 100m1 三角瓶 4 个，编号。向各瓶准确加入稀释后的酶液 10m1，立即向 3、4 号瓶中加入 18mol/L 硫酸 5ml 以终止酶的活动，作为空白。然后将各瓶放在 20水浴中保温，待瓶内溶液温度达 20时，向各瓶准确加入 58ml 0.05mol/L 过氧化氢，摇匀并记录加入时间。继续在 20浴中作用 5min 后，再依次向 1、2 号瓶加入 1.8mol/L 硫酸 5ml，终止反应。3滴定 取出 4 个瓶，各加入 1m1 20碘化钾，3 滴钼酸铵及 5 滴淀粉指示剂，用 0.01mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失。记录空白(3、4 号)与样品(1、2 号)滴定值。四、实验结果 按下列公式，计算被测材料的过氧化氢酶活性。被分解 H2O2 量（mg）=（V 0-V1） C17CAT 活性（ mgH2O2g-1min-1）=mVt/VrWtV0：空白滴定值（ ml）V1：样品滴定只（ ml）C：Na 2S2O3 的浓度（mol/L）m：被分解 H2O2 的质量（mg）Vt：提取酶液总体积（ml）Vr： 测定取用酶液量（ml）W：样品质量（g）t：反应时间（min）17:1mmol Na2S2O3 相当 H2O2 量（ mg）
