1、实验 40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使 H2O2 发生累积。H 2O2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中 H2O2 含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2 与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物钛复合物黄色沉淀，可被 H SO4 溶解后，在 415nm 波长下比色测
2、定。在一定范围内，其颜色深浅与 H2O2 浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵；移液管 0.2ml2 支，5ml1 支；容量瓶 10ml7 个，离心管 5ml8 支；离心机；分光光度计。【试剂】100mol/L H2O2 丙酮试剂：取 30%分析纯 H2O2 57l ，溶于 100ml，再稀释 100 倍；2mol/L 硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】1.制作标准曲线：取 10ml 离心管 7 支，顺序编号，并按表 40-1 加入试剂。表 40-1 测定 H2O2 浓度标准曲线配置表离 心 管 号试剂（ml）1 2 3 4 5 6 7100mol/L H 2O2 0 0.1 0
3、.2 0.4 0.6 0.8 1.04下预冷丙酮 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 05%硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.23000r/min 离心 10min，弃去上清夜，留沉淀2mol 硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入 10ml 容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至 10ml 刻度，415nm 波长下比色。2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织 25g（视 H2O2 含量多少而定） ，按材料与提取剂 1
4、1 的比例加入 4下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管 3000 r/min 下离心 10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表 35-1 加入 5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后 3000rpm/min 离心 10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤 35 次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入 2mol硫酸 5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：植物组织中 H2O2 含量(mol/g Fw)=CVtFW1式中 C标准曲线上查得样品中 H2O2 浓度（mol） ；Vt样品提取液总体积（ml） ；V1
5、测定时用样品提取液体积（ ml） ；FW植物组织鲜重（g） 。二、过氧化氢酶的活性测定高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。R(Fe+2)+H2O2=R(Fe+3+OH )R(Fe+3OH )2+H2O2=R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据 H2O2 的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的 H2O2 溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+
6、2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的 H2O2 的量。【仪器和用具】研钵；三角瓶 50ml4；酸式滴定管（10ml） ；恒温水浴；容量瓶 25ml1。【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8；0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用 0.1mol/L 草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售 30% H2O2 大约等于 17.6mol/L，取 30% H2O2 溶液 5.68ml，稀释至 1000ml，用标准 0.1mol/ KMnO4 溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1
7、mol/L 草酸：称取优级纯 H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至 1L。【方法】 1.酶液提取 取小麦叶片 2.5g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心 15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2.取 50ml 三角瓶 4 个（两个测定两个对照） ，测定瓶中加入酶液 2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于 30恒温水浴中保温 10min，立即加入 10% H2SO4 2.5m
8、l。3.用 0.1mol/L KMn 4 标准溶液滴定 H2O2，至出现粉红色（在 30min 内不消失）为终点。2e2e4.结果计算： 酶活性用每克鲜重样品 1min 内分解 H2O2 的毫克数表示：酶活(mgH 2O2/gFWmin)=().ABVFWtT17式中 A对照 KMnO4 滴定毫升数；B酶反应后 KMnO4 滴定毫升数；VT酶液总量（ml） ；V1反应所用酶液量（ ml）;W样品鲜重（g） ；1.71ml 0.1mol/L 的 KMnO4 相当于 1.7mg H2O2。【注意】所用 KMnO4 溶液及 H2O2 溶液临用前要经过重新标定。三、过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理
9、】H2O2 在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶 1 个； 0.5ml 刻度吸管 2 支，2ml 刻度吸管 1 支；10ml 试管 3 支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮） ；0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定） 。【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织 0.5g 置研钵中，加入 23ml 4下预冷的 pH7.0 磷酸
10、缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置 5冰箱中静置 10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5下保存备用。2.测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表 40-2 顺序加入试剂。表 40-2 紫外吸收法测定 H2O2 样品液配置表管 号 S1 S2 S3粗酶液(ml) 0.0 0.2 0.2pH7.8 磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.025预热后,逐管加入 0.3ml 0.1mo
11、l/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算： 以 1min 内 A240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（u） 。过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= FWtV.AT240式中 A240 = AS0()S1AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积（ml） ；V1测定用粗酶液体积（ ml） ；FW样品鲜重（g） ；0.1A240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（u） ；t加过氧化氢到最后一次读数时间（ min） 。【注意事项】 凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
